论文部分内容阅读
刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的机会性顶复门原虫,能够入侵几乎所有的温血脊椎动物的有核细胞,并引起弓形虫病(Toxoplasmosis)。该病呈全球性分布,全世界约有三分之一的人群感染,截至目前,尚无安全、有效的疫苗和药物来抵抗该种人兽共患寄生虫病。棒状体是顶复门原虫所特有的一种分泌型亚细胞器,其分泌的蛋白根据定位的不同主要分为两亚类,即位于棒状体基部的基部蛋白(rhoptry proteins,ROPs)和位于棒状体颈部的颈部蛋白(rhoptry neck proteins,RONs)。现今,已被发现并证实的弓形虫棒状体颈部蛋白包括TgRON1、TgRON2、TgRON3、TgRON4、TgRON5、TgRON6、TgRON8、TgRON9以及TgRON10等。已有诸多研究表明,弓形虫棒状体颈部蛋白与虫体入侵宿主细胞机制呈密切相关的,是该原虫的毒力因子之一。试验一:为探究弓形虫不同发育时期棒状体颈部蛋白5(RON5)基因的转录与表达水平与其毒力的相关性,本次研究首先以9株不同宿主及地理来源的弓形虫分离株的基因组DNA为模板,通过PCR扩增弓形虫棒状体颈部蛋白5基因的部分序列,并进行测序,并对所得基因进行同源性分析、序列比对和种系发育树的构建。所得结果表明RON5基因不能有效地区分不同基因型的弓形虫,故其不可作为弓形虫遗传标记分子。将弓形虫PRU株RON5基因的编码序列翻译为氨基酸序列,运用在线分析系统进行蛋白结构分析和抗原表位预测。结果显示RON5蛋白共有28个α-螺旋、45个β-折叠、9个β-转角、18个无规则卷曲和16个B细胞抗原表位,其中含有14个亲水区域及一个跨膜区,初步认为该可溶性蛋白具有较强的免疫原性,可作为抗弓形虫疫苗候选分子。试验二:以弓形虫II型PRU株作为研究对象,以弓形虫管家基因TgACT1作为内参基因,分别对目的基因TgRON5和内参基因设计特异性引物,采用实时荧光定量PCR相对定量法对弓形虫速殖子、缓殖子、未孢子化卵囊及孢子化卵囊四个不同发育阶段中TgRON5基因mRNA表达情况进行检测与分析。根据弓形虫RON5基因3’-端编码序列和弓形虫肌动蛋白(actin,ACT1)编码区全序列设计特异性引物,扩增目的基因,将目的基因转化至原核表达载体,分别构建原核表达载体pET30a-RON5_C和pET30a-ACT1,IPTG诱导表达,对所表达的蛋白进行纯化,分别用重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,采用Western-blot分析RON5蛋白在弓形虫不同发育时期的相对表达水平。荧光定量PCR结果显示,TgRON5基因在弓形虫各发育时期均有表达,其中以孢子化卵囊时期表达水平最高,未孢子化卵囊次之,速殖子较低,缓殖子最低。所构建的原核表达质粒pET30a-RON5_C和pET30a-ACT1经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳检测可发现61 kDa(RON5)和53 kDa(actin)左右目的蛋白,与预期结果相一致。所制备的多克隆抗体经SDS-PAGE电泳检测结果显示,分别存在53 kDa和22 kDa两条带,与目的条带大小相一致。此外,Western blotting分析显示,RON5蛋白在弓形虫各个发育时期均有表达,且以孢子化卵囊相对表达量最高。综上所述,TgRON5基因是高度保守的,其不能作为弓形虫基因型的遗传标记分子;RON5蛋白以及mRNA表达量在弓形虫不同发育时期差异性分析表明,均以孢子化卵囊时期表达量最高。由此初步认为,该抗原作为弓形虫在入侵宿主细胞时发挥重要作用的毒力因子之一,RON5蛋白表达水平与弓形虫的侵袭力可能呈一定的相关性。