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寨卡病毒病是由寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）感染引起的一种急性传染病。ZIKV属于黄病毒科黄病毒属,1947年首次在非洲乌干达地区发现,最初被认为是对人类不构成威胁的病毒,直到2015～2016年,ZIKV在巴西暴发并迅速扩散至全球,同时发现其与新生儿小头畸形和成人格林-巴利综合征有关,引起世界高度关注。2016年2月1日,WHO宣布ZIKV疫情为“国际关注的公共卫生事件”。此外,ZIKV还可以引起男性生殖系统损伤、眼部疾病、听力下降、心脏损伤、脑膜炎、血小板减少综合征等多种疾病。与其他多数黄病毒不同,ZIKV除了可以通过蚊媒传播之外,还可以通过母婴传播和性传播。然而,目前尚无针对ZIKV的预防性疫苗或特效抗病毒药物,亟需开展相关研究。高效精确的免疫分析技术体系和体内外感染模型是研制新型疫苗的重要基础。为此,本研究重点开展ZIKV疫苗等研究所需的免疫分析方法和体内外感染模型研究,探索建立高效的ZIKV中和抗体快速检测方法和重要保护性抗原免疫检测方法,探索发展基于非免疫缺陷小鼠的ZIKV动物感染模型,并初步开展候选疫苗和中和性抗体的筛选与评价,为推进新型ZIKV疫苗或治疗药物研究提供基础和支持。本研究首先开展了 ZIKV单克隆抗体制备,分别以ZIKV毒株培养液、展示包膜蛋白E表位的HBcAg重组蛋白颗粒、原核表达的重组蛋白作为免疫原免疫小鼠,共制备获得14株ZIKV单抗。中和抗体水平是反映ZIKV疫苗有效性的重要指标,然而,传统的中和方法存在检测周期长、通量低的缺点,难以用于大量样本的中和抗体检测。为此,本研究基于酶联免疫斑点检测法（ELISPOT）,以标记辣根过氧化物酶（HRP）的抗体11C11作为检测抗体建立了 ZIKV中和试验方法Nt-ELISPOT。该方法能够在48h内完成检测,并与传统基于细胞病变反应的Nt-CPE中和试验方法具有较好一致性,同时可以用于不同型别的ZIKV毒株检测和ZIKV中和抗体筛选,以及大规模血清流行病学调查研究。应用该方法初步对2016年厦门市健康人群队列的510份血清样本进行ZIKV中和抗体效价的横断面分析研究,发现血清中ZIKV中和抗体均为阴性,提示该地区总体不存在ZIKV的既往感染。ZIKV的包膜蛋白E已被证明是主要保护性抗原,E抗原的定量检测对疫苗质控具有重要意义,本研究进一步通过筛选E蛋白抗体配对,基于双抗体夹心ELISA建立了 E抗原定量检测系统。结果显示,该系统对E抗原的检测灵敏度达0.48 ng/mL,可以实现不同型别的ZIKV毒株中天然E抗原检测,同时E抗原含量与病毒滴度之间具有良好的相关性,提示该方法可应用于疫苗保护性抗原活性和病毒滴度的快速监测。动物感染模型是开展疫苗或抗病毒药物评价的重要工具。本研究通过分析可能影响小鼠病征的多种因素,基于C57BL/6乳鼠建立了非免疫缺陷小鼠感染模型,小鼠在攻毒后可以表现出瘫痪、震颤、共济失调等神经损伤症状。通过组织水平检测与分析,发现ZIKV可以感染以脑和脊柱为主的多种组织脏器,为ZIKV引起的神经损伤提供良好研究模型。本研究发现感染中后期的乳鼠尿液中可以检测到较高含量的病毒核酸,证实尿液可以作为ZIKV诊断标本。发现ZIKV感染可以引起血清中CCL2和CXCL10含量显著升高。此外,心脏是人体的重要器官,由于ZIKV可以引起患者心律失常、心脏衰竭等心脏相关疾病,本研究基于体内外感染模型初步开展了 ZIKV感染对心脏的影响研究,发现攻毒组C57BL/6乳鼠或3～4周龄A129小鼠在感染中期出现心脏肿大、血清中心肌相关酶（如CK-MB、CK、LDH和α-HBDH）含量升高、心律失常等现象。本研究进一步探讨了 ZIKV引起心脏损伤的可能机制,结果显示,攻毒组乳鼠心脏组织中CXCL10表达量显著增高,细胞凋亡信号Cleavedcaspase-3呈现阳性,同时ZIKV可以引起H9c2心肌细胞和C57BL/6乳鼠、A129小鼠心肌组织中Cx43蛋白表达下调,可以为ZIKV致病机制和防治研究提供新的思路。本研究进一步基于灭活疫苗和中和抗体探究了以上免疫分析方法和动物感染模型的应用潜力。通过E抗原定量检测体系和病毒滴度检测确定较优的病毒培养条件,并制备获得ZIKV病毒颗粒,经甲醛灭活和氢氧化铝佐剂吸附后免疫小鼠,可刺激小鼠体内产生高水平中和抗体,其免疫血清和母传抗体可以有效保护乳鼠抵抗ZIKV致死性攻毒。此外,本研究采用Nt-ELISPOT方法对前期制备的ZIKV中和抗体进行体外抗病毒活性分析,并发现中和抗体在乳鼠攻毒模型中具有一定预防效果,而采用多针治疗的策略也可以延缓小鼠发病时间。综上所述,本研究建立了快速高通量的ZIKV Nt-ELISPOT中和试验方法和E抗原定量检测系统,并系统地建立了 ZIKV乳鼠感染模型。上述检测方法与模型可以应用于中和抗体效价的检测、中和抗体的筛选、大规模血清流行病学的初步调查、疫苗生产工艺的优化、ZIKV感染对心脏组织的影响分析,以及ZIKV疫苗和抗体的体内有效性评价等相关研究,本研究将为推进ZIKV新型疫苗或抗体、抗病毒药物研究提供重要基础和支持。