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自发性脑出血(Intracerebral hemorrhage, ICH)在我国占急性脑血管病的30%左右,急性期病死率约为30%-40%,是急性脑血管病中最高的,具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点。血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)损伤是脑出血后水肿形成的重要机制之一,而脑水肿是脑出血患者病情恶化和死亡的重要原因,控制脑水肿降低颅内压是脑出血治疗的重点之一。Zhang等人研究发现外源性神经元性丝氨酸蛋白酶抑制剂(Neuroserpin, NSP)能够减少脑缺血后脑血管通透性的增加从而减少BBB损伤。目前国内外关于NSP在缺血性卒中及癫痫等疾病中的神经保护作用已有诸多研究,但罕有脑出血中NSP作用的相关研究,我们希望通过实验探讨NSP在脑出血中对BBB的影响,寻找脑出血临床治疗的新策略。本课题首先通过免疫荧光、Western blot观察比较脑出血小鼠在干预后24h/48h/72h不同时间点血肿周边脑组织NSP蛋白较空白对照及假手术组表达变化情况,并分析其随时间变化趋势；然后通过神经功能缺损评分、干湿重法测定脑组织含水量、伊文思蓝(Evans blue, EB)法检测BBB通透性,研究脑出血后外源性皮质注射NSP蛋白溶液相较单纯脑出血组在24h/48h/72h各时间点是否减少BBB损伤从而减轻脑水肿,并分析其时间相关性；进一步在干预后48h通过免疫荧光观察脑出血后外源性注射NSP能否减轻BBB结构破坏,通过Western blot检测NSP干预后血肿周边区域BBB重要结构蛋白occludin表达变化情况。本实验探讨脑出血后NSP蛋白表达的调节,研究其在脑出血小鼠中对BBB的影响,并进一步探究其对BBB作用的机制,为NSP对BBB影响提供理论依据,可能为脑出血的临床治疗提供新的策略。第一部分：观察脑出血后血肿周围NSP蛋白表达及其随时间变化情况目的：观察小鼠自体血注射法行脑出血造模后在24h/48h/72h不同时间点血肿周围脑组织NSP蛋白表达较空白对照组及假手术组变化情况,并分析其随时间变化趋势。方法：将C57BL/6J小鼠随机分为空白对照组、假手术组、脑出血组,脑出血组分为24h、48h、72h三个亚组。空白对照组小鼠不予任何处理直接处死,假手术组小鼠在建立假手术模型后24h处死,脑出血各亚组小鼠建立脑出血模型后在相应时间点处死,所有小鼠处死前进行神经功能缺损评分。通过免疫荧光及Western blot法观察脑出血小鼠在干预后24h/48h/72h不同时间点血肿周边脑组织NSP蛋白较空白对照及假手术组表达变化情况。结果：1.神经功能缺损评分结果显示脑出血各亚组小鼠神经功能缺损评分较空白对照组及假手术组均显著升高(p<0.01),脑出血48h亚组较24h亚组神经功能缺损评分显著升高(p<0.05)。2.免疫荧光结果显示脑出血各亚组小鼠血肿周边区域NSP蛋白表达较空白对照组及假手术组显著升高,尤其在血肿浅部皮质区域高表达最为明显,脑出血48h组较明显。3.Western blot结果显示脑出血各亚组小鼠血肿周边区域NSP蛋白表达较空白对照组及假手术组显著升高(p<0.01),脑出血48h组NSP表达均值最高,但脑出血各亚组之间无统计学差异。结论：1.脑出血后小鼠神经功能受损。2.脑出血后小鼠血肿周边区域组织NSP蛋白表达水平显著升高,但随时间变化趋势不明显。第二部分：研究脑出血后外源性给予NSP对脑水肿及血脑屏障损伤程度的影响及其时间相关性目的：研究小鼠脑出血后即刻予血肿浅部皮质外源性注射NSP蛋白溶液,相对假手术组和单纯脑出血组小鼠在干预后24h/48h/72h不同时间点神经功能缺损、脑水肿及血脑屏障损伤程度变化情况,并分析其时间相关性。方法：将C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、ICH组、ICH+NSP组,ICH组及ICH+NSP组各分为24h/48h/72h三个亚组,假手术组小鼠在建立假手术模型后24h处死,脑出血组小鼠建立脑出血模型,脑出血+NSP组小鼠建立脑出血模型后予外源性NSP注射,各组小鼠在干预后相应时间点处死,所有小鼠处死前进行神经功能缺损评分。通过干湿法测定脑组织含水量、EB法测定BBB通透性,评估不同时间点脑出血后外源性注射NSP对脑水肿及BBB损伤程度的影响。结果：1.神经功能缺损评分结果显示ICH及ICH+NSP各亚组神经功能缺损评分均较假手术组显著升高(p<0.01)；ICH+NSP48h组较ICH48h组神经功能评分显著降低(p<0.01); ICH+NSP72h组较ICH48h组神经功能评分显著降低(p<0.05); ICH+NSP24h组较ICH48h组神经功能评分无显著性差异(p=0.076)。2.脑组织含水量测定显示ICH24h/48h/72h亚组及ICH+NSP48h/72h亚组脑组织含水量均较假手术组显著升高(p<0.01); ICH+NSP24h组较ICH24h组脑组织含水量显著降低(p<0.05); ICH+NSP48h/72h组较ICH48h/72h组脑组织含水量显著降低(p<0.01)。3.EB法测定BBB通透性显示ICH及ICH+NSP各亚组脑组织EB含量均较假手术组显著升高(p<0.01); ICH+NSP24h/48h亚组较ICH24h/48h亚组脑组织EB含量显著降低(p<0.01); ICH+NSP72h亚组较ICH72h亚组脑组织EB含量显著降低(p<0.05)。结论：1.脑出血后小鼠神经功能受损,脑出血后予血肿周皮质外源性注射NSP在干预24h以后可见神经功能缺损明显减轻；2.脑出血后外源性给予NSP干预能够明显减少脑组织含水量,即减轻脑水肿；3.脑出血后外源性给予NSP能够明显减少脑组织伊文思蓝含量,即减少血脑屏障通透性。第三部分：探讨脑出血并外源性给予NSP后48h血脑屏障结构蛋白occludin表达的变化情况目的：研究小鼠脑出血后即刻予血肿浅部皮质外源性注射NSP蛋白溶液,相对假手术组和单纯脑出血组小鼠在干预后48h血脑屏障结构蛋白occludin表达水平变化情况。方法：将C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、脑出血组、脑出血+NSP组。假手术组小鼠建立假手术模型,脑出血组小鼠建立脑出血模型,脑出血+NSP组小鼠建立脑出血模型后予外源性注射NSP,所有小鼠在干预后48h处死。通过免疫荧光观察各组小鼠BBB结构改变情况及occludin蛋白表达情况,并通过Western blot检测正常纹状体或血肿周边脑组织occludin蛋白表达水平变化情况。结果：1.免疫荧光结果显示脑出血后小鼠血脑屏障结构蛋白occludin表达较假手术组分布明显紊乱,微血管周occludin蛋白表达明显减少,但总表达量未见明显差异；脑出血+NSP组小鼠血脑屏障结构蛋白occludin表达分布紊乱情况较脑出血组有好转,微血管周occludin表达较单纯脑出血组明显增加,但总表达量未见明显差异。2.Western blot结果显示假手术组、脑出血组、脑出血+NSP组各组间血肿周边区域occludin总蛋白表达水平无显著差异(p>0.05)。结论：1.小鼠脑出血后血肿周边区域血脑屏障结构蛋白occludin表达分布紊乱,微血管周occludin表达明显减少,但总表达量未见明显差异；脑出血后外源性给予NSP能够在一定程度上改善occludin蛋白分布紊乱情况,使微血管周occludin蛋白表达明显增加,但总表达量未见明显差异。2.脑出血小鼠不论是否外源性给予NSP,血肿周边区域组织occludin总蛋白表达水平均未见明显改变。总结：小鼠脑出血后血肿周边区域脑组织NSP蛋白表达水平升高,脑出血后即刻予外源性NSP干预能够减轻血脑屏障损伤及脑水肿程度,脑出血后BBB结构蛋白occludin表达分布紊乱,微血管周表达量下降,出血后予外源性NSP干预能够改善上述情况。