论文部分内容阅读
目的: 观察姜黄素暴露于大鼠神经干细胞后，是否对神经干细胞的增殖产生影响。观察姜黄素对发育相关基因(GR，Stat3，Notch1，P21)及其蛋白的影响，并探讨其相关影响机制。 方法: 神经干细胞的获取和培养:取孕15天(E15) SD大鼠，麻醉后取其大脑皮质，分离出原代神经干细胞接种到DMEM/F12的完全培养基中进行培养，稳定传代至第二代进行神经干细胞标志蛋白(nestin)和胚胎干细胞关键蛋白(SOX2)进行神经干细胞染色鉴定及姜黄素暴露处理。姜黄素处理:实验随机分为三组，分别为对照组(Control group)，溶剂组(DMSO group)，姜黄素组(Curcumin group)，对照组无任何处理，溶剂组为0.1％二甲基亚砜(DMSO)，姜黄素组中姜黄素的的浓度分别为0.1，0.5，2.5，12.5，62.5μM，溶于0.1％ DMSO中，暴露时间为24 h。姜黄素对神经干细胞的毒性、活力及增殖作用检测:姜黄素暴露大鼠神经干细胞24 h后，乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒性;MTT法检测细胞活力及BrDU增殖试剂盒检测神经干细胞的增殖。选择无细胞毒性且促进神经干细胞增殖作用最强的姜黄素剂量组，重新进行实验分组:对照组(control group)，溶剂组(DMSOgroup)，姜黄素组(Curcumin)，进行神经干细胞暴露，24 h后提取细胞RNA及蛋白，标本冻存待用。基因及蛋白检测:荧光定量聚合酶链反应法(qPCR)检测神经干细胞GR，Stat3，Notch1和P21 mRNA表达;Western blot法检测神经干细胞GR，Stat3， p-Stat3蛋白表达。 结果: 免疫细胞化学染色结果显示，原代细胞经Nestin和SOX2蛋白染色阳性率大于98％，经鉴定为神经干细胞。LDH法检测结果显示12.5和62.5μM组姜黄素对神经干细胞具有细胞毒性作用（P0.05），其他剂量无影响;MTT结果显示0.5，2.5μM组姜黄素可增强神经干细胞活力，62.5μM组姜黄素降低神经干细胞活力（均P＜0.05)，其他剂量无影响;BrDU结果显示0.1，0.5，2.5μM组姜黄素促进神经干细胞增殖（P＜0.05)，12.5，62.5μM组姜黄素抑制神经干细胞增殖（均P＜0.05），其他剂量无影响。以上实验表明低剂量组姜黄素无细胞毒性作用且0.5μM组姜黄素对神经干细胞的增殖促进作用最强，因此姜黄素分组重新设定为0.5μM组进行后续基因蛋白检测。qPCR结果显示，0.5μM剂量组GR mRNA表达量发生明显降低（P＜0.05），其他剂量无变化;Western Blot结果表明，0.5μM剂量组GR，Stat3，p-Stat3蛋白表达量均发生降低（P＜0.05），其他剂量无变化。 结论: 姜黄素促进神经干细胞增殖，可能与其抑制GR有关，其机制可能与姜黄素抑制GR mRNA及蛋白水平的表达，同时也可能通过GR与ERK和Stat3通路的交互作用，直接或间接调节Stat3蛋白表达，最后调控细胞的增殖。