论文部分内容阅读
肾癌,即肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)。在泌尿系统中,肾癌是发生率最高的肿瘤之一,其恶性度较高,具有很强的致死性。然而,由于肾癌发病隐匿,无明显、典型的特异性症状,在发现时,部分肾癌患者已处于中晚期,或者合并局部或远处转移。尽管手术切除肿瘤是目前最有效的治疗措施,但仍有一部分患者在手术后发生远处转移,并引起不良的预后。此外,由于肾癌对放疗、化疗并不敏感,靶向药物治疗效果也有限,因此,在临床上,早期发现及诊断肾癌,早期判断肾癌患者的预后,对于肾癌的治疗有重要意义。透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是肾癌所有病理类型里最主要的,其最主要的组织病理学特点即是细胞内大量脂质堆积。最近的研究表明,脂质代谢在多种肿瘤的发生、发展中扮演着重要角色,然而,脂质代谢在肾透明细胞癌中的作用尚未完全阐明。此外,多种研究也表明,高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)及其受体(high density lipoprotein receptor,HDL-R)在细胞内脂质堆积的过程中起着主导作用。清道夫受体B类1型(Scavenger receptor class B type 1,SR-B1)即是一种主要的高密度脂蛋白受体,在介导肿瘤细胞对脂质的摄入起着重要作用。基于此,为探讨脂质代谢在肾透明细胞癌中的作用,本研究拟从以下三部分进行阐述:第一部分SR-B1在肾透明细胞癌中的表达目的:探讨SR-B1在肾透明细胞癌组织中的表达状态,为后续研究做铺垫。方法:ccRCC患者经手术治疗后,选取一定数量的手术切除的配对肿瘤标本和癌旁正常肾脏组织标本,运用实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot来检测SR-B1在ccRCC肿瘤组织和配对癌旁组织中的表达;同时选取配对的ccRCC肿瘤组织及癌旁组织分别行油红(oil red o,ORO)染色、HE(hematoxylin-eosin)染色及免疫组化(immunohistochemistry,IHC)染色。结果:在对选取的100对ccRCC肿瘤组织及癌旁组织行实时定量PCR(qRT-PCR)时,发现SR-B1的mRNA在ccRCC肿瘤组织中表达明显升高(P<0.001);此外,在选取的10对配对组织行Western blot实验,检测发现SR-B1的蛋白水平在ccRCC肿瘤组织中也明显高于正常癌旁组织;油红实验及HE染色证实ccRCC肿瘤组织中有明显脂质沉积而配对正常癌旁组织中则很少,免疫组化实验也证实SR-B1的蛋白表达水平在ccRCC肿瘤组织中也明显高于癌旁组织。结论:SR-B1在ccRCC透明细胞癌患者的肿瘤组织中明显高表达;透明细胞癌组织细胞中脂质沉积丰富。第二部分SR-B1在肾透明细胞癌中的临床价值目的:研究SR-B1的表达在肾透明细胞癌中的临床价值,包括诊断价值及预后价值,为ccRCC患者的早期诊断,早期治疗和早期判断预后提供借鉴意义。方法:选取一定例数的ccRCC配对肿瘤组织及癌旁组织,运用实时定量PCR检测组织中SR-B1的表达水平,根据表达水平做受试者工作曲线(receiver operating characteristic,ROC),根据最佳特异度、灵敏度,选择曲线下面积(area under the curve,AUC)最大时的数值,确定其诊断价值。同理,扩大样本量,检测配对ccRCC肿瘤组织和癌旁组织的SR-B1表达水平,分析其表达水平与临床特征的关系,并做Kaplan-Meier曲线和COX回归分析,判断其预后意义。结果:根据SR-B1在100对配对的ccRCC肿瘤组织和癌旁组织中的表达水平,行ROC曲线,显示SR-B1表达水平区别ccRCC肿瘤组织与癌旁组织的AUC值为0.8486(95%confidence interval 0.7926-0.9045),敏感性为 0.75(95%confidence interval 0.6535-0.8312),特异性为 0.90(95%confidence interval 0.8238-0.9510)。扩大样本总量至113例,发现ccRCC肿瘤组织中SR-B1的表达水平与肿瘤大小、核分级、远处转移等临床特征有统计学意义(P值分别为P=0.019,P=0.040,P=0.006)。Kaplan-Meier曲线显示SR-B1表达水平与无进展生存期(progression-free survival,PFS)有统计学意义(P=0.0062),SR-B1表达水平越高,患者PFS越短。COX回归模型分析显示:行单因素分析(Univariate analysis)时,患者的临床特征如性别、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、SR-B1的表达有统计学意义(P值分别为P=0.029,P=0.004,P=0.000,P=0.001,P=0.000,P=0.009),说明这些特征可以作为 ccRCC患者的预后因素,预测患者PFS长短;行多因素分析(Multivariate analysis)时,仅有性别、肿瘤大小、SR-B1的表达有统计学意义(P值分别为P=0.000,P=0.002,P=0.021),说明此三个临床临床特征可以作为独立的预后因子。结论:SR-B1的表达水平可以作为ccRCC的早期诊断标志物;SR-B1的高表达与ccRCC的侵袭性特征具有明显相关性,且可以作为判断ccRCC患者预后的独立预测因子。第三部分SR-B1在肾透明细胞癌中的生物学作用目的:研究SR-B1的表达在肾透明细胞癌中的生物学作用,为ccRCC患者的基因靶向治疗提供参考意义。方法:根据SR-B1在ccRCC组织中的高表达状态,设计其特异性的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA),同时设计合成阴性对照序列。在肾透明细胞癌细胞系786-0和Caki-1细胞中检测SR-B1-siRNA的沉默效果。分析SR-B1基因沉默后对细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移等生物学行为的影响,进而判断其生物学功能。结果:特异性的siRNA能在蛋白水平显著的降低SR-B1在ccRCC细胞系中的表达;MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide]实验检测发现,SR-B1表达被降低或沉默后,能显著抑制ccRCC细胞的增殖;克隆形成实验检测发现,用siRNA干扰SR-B1的表达后,能明显降低ccRCC细胞的集落形成能力;Transwell实验说明,ccRCC细胞的侵袭和迁移能力在SR-B1表达下调后都明显减弱;划痕实验证实,在SR-B1表达被特异性下调后,细胞的划痕愈合能力也明显下降。结论:在SR-B1的表达被特异性下调后,ccRCC细胞系的生物学行为被显著抑制,推测SR-B1可能作为ccRCC中的一个促癌基因。