在有花植物中,雌配子体起始于胚珠原基顶端表皮下的一个珠心细胞,这个细胞随后分化为大孢子母细胞。大孢子母细胞经过两次连续的分裂形成四个单倍体的大孢子。在拟南芥中,其中三个孢子进行细胞程序性死亡,只留下合点端的一个大孢子,该细胞最终发育成为功能大孢子。功能大孢子进行连续的三次核分裂形成一个八核的合胞体。经细胞化之后形成一个七胞八核的胚囊结构:合点端的三个反足细胞,含有一个中央大液泡的中央细胞,以及珠孔端的两个助细胞和一个卵细胞。这样,成熟雌配子体即胚囊中含有四种细胞类型,共计七个细胞。在雌配子体的发育过程中,历经细胞化、细胞命运决定、细胞功能特化等重要发育生物学过程,尤其是雌配子的分化和受精前后基因表达的变化涉及双受精的分子机制、合子激活,及父母亲本基因的作用等重大发育生物学核心问题。因此,历来被受瞩目。但由于技术限制,迄今对有关问题的认识仍不甚了了。因此,胚囊成员细胞的分离一直是植物有性生殖研究领域一个重要的内容。这些细胞的成功分离无疑对于胚囊成员细胞的转录组差异、细胞类型特异基因的筛选、体外培养、以及对于胚囊成员细胞命运决定分子机制的研究有着重要的意义。虽然前人在胚囊成员细胞的分离以及培养方面做了大量的研究,但在模式植物拟南芥中,胚囊成员细胞的分离却鲜有进展。因此,拟南芥终胚囊成员细胞的分离成为了一个限制我们利用这一模式植物进行相关研究的重点和难点。在本工作中,我们从胚囊成员细胞的分离着手,摸索并建立了在拟南芥中分离卵细胞,助细胞,中央细胞,反足细胞以及合子的方法。我们利用少量细胞的转录组测序技术对卵细胞、合子以及反足细胞进行了转录组测序。利用生物信息学技术,结合数据库中已经发表的早期胚胎的转录组数据,我们对这些数据进行了深入的分析和挖掘,为今后胚囊成员细胞以及合子的研究奠定了基础。有关工作包括下列几个方面:1.我们结合前人的研究成果,首次在拟南芥中利用酶解法或非酶解法分离出卵细胞、助细胞、合子以及反足细胞。同时,我们对中央细胞的分离方法也进行了探索,分别建立了分离各种类型细胞的最适条件和操作流程。我们优化的技术流程可以确保在短时间内小批量的分离高质量的卵细胞、合子及中央细胞等,能够满足后期工作的需要。其中,中央细胞的分离最为困难,以我们的技术最终能够分离出中央细胞,但多数分离的中央细胞都是丢失部分细胞质的亚原生质体。2.我们利用少量细胞的mRNA提取和cDNA扩增试剂盒,对分离的卵细胞,合子,反足细胞进行了 mRNA提取和cDNA扩增。建立了可信的技术流程,可确保mRNA的质量能满足后期分析的需要。我们对这些样品进行了转录组测序,获得了大量难得的数据,为探讨感兴趣的理论问题奠定了坚实的基础。3.我们利用生物信息学技术,分别对卵细胞,合子,反足细胞的转录组数据进行了深入的分析。发现若干突出特点:首先,我们发现无论是卵细胞,合子还是反足细胞,都表达大量分泌性的蛋白,其中部分蛋白已经被认为具有非常重要的功能比如EC1多肽。第二,卵细胞和合子表达的基因数目要远远多于反足细胞。第三,在卵细胞和合子中表达了很多在根毛发育中起作用的基因。第四,我们分析了在卵细胞,合子和反足细胞中表达的转录因子和蛋白激酶,发现其在受精前后的发育变化中可能有重要作用。此外,我们利用数据库发表的早期胚胎的转录组数据,获得了大量有价值的差异基因数据。这些数据的分析对于胚囊成员细胞的命运决定,功能特化,合子激活等重要生物学问题的研究提供了大量有价值的线索。4.我们重点分析了卵细胞特异表达基因,有选择的筛选了 Egg1-Egg7进行详细的表达模式分析。首先,我们利用RT-PCR对Egg1-Egg7在根茎叶花中的表达模式进行了分析,然后,我们利用融合蛋白对Egg1-Egg7进行了表达模式的分析,结果发现,Egg1-Egg6都在卵细胞中特异表达。Egg7在卵细胞和花粉中表达。进一步,我们利用启动子活性分析和少量细胞的RT-PCR对Egg1和Egg2进行了更严格的分析,从融合蛋白,启动子活性和mRNA水平上证明了 Egg1和Egg2确为卵细胞特异表达基因。其后续功能分析正在进行中。