研究背景:糖尿病是世界范围内的一种慢性病,其患病率呈大幅上升趋势。其中,糖尿病创面（Diabetic wound,DW）是临床上最常见的慢性并发症之一,最好发的部位是足部皮肤,具有高致残率、高致死率、高经济负担的特点。随着糖尿病患病率的攀升,糖尿病创面的问题日益严重,不仅影响患者身心健康和生存质量,也给家庭和社会带来巨大的经济压力。因此,阐明糖尿病创面难愈的病理分子机制,寻找有效可行的干预靶标,成为糖尿病相关领域的研究热点和难点。血管内皮细胞是血管最内层的基本结构,是血液与血管平滑肌和组织间的机械屏障。作为血管壁的组成部分,血管内皮细胞可感知血液动力学和血液成分的变化,合成、代谢和分泌一系列生物活性大分子维持血管稳态和功能,在诸如炎症反应、凝血、血管生成和创面愈合等生理过程中发挥重要作用。血管生成障碍是糖尿病创面难愈的主要机制之一。本课题组在前期研究中发现糖尿病创面患者溃疡组织中血管内皮细胞分布无序,无法有效形成血管管腔,且炎性因子表达水平升高、促血管生成因子表达水平降低,这表明糖尿病创面患者溃疡组织中的内皮细胞存在损伤和血管生成障碍。此外,我们使用人血清条件培养基孵育体外培养的皮肤组织,发现与健康对照者血清孵育的皮肤组织相比,患者血清孵育的组织中血管数量明显减少,且IL-1β和IL-6等炎性因子的表达水平升高,促血管生成因子VEGF的表达水平降低,这与我们在患者溃疡组织中观察到的现象相一致。故推测糖尿病创面患者血清是引起血管内皮损伤和功能障碍的重要因素,因此课题组进一步使用人血清条件培养基孵育脐静脉内皮细胞,观察到糖尿病创面患者血清可以诱导内皮细胞衰老和周期紊乱。那么,患者血清到底是通过何种机制诱导血管内皮损伤和功能障碍,这一问题的解答将为糖尿病难愈创面及其他血管相关并发症的防治提供新策略。组蛋白翻译后修饰是表观遗传学的重要研究内容之一,主要包括组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化和泛素化等,这些修饰可以影响基因转录活性,并由此决定细胞的状态和命运。在高等生物的细胞核中,DNA链与组蛋白相互包绕形成细胞核内染色质的基本单元核小体,基因转录时核小体需打开以暴露DNA链。组蛋白翻译后修饰可极大的影响核小体的开放从而影响基因的转录。一般来说,组蛋白H3第27位赖氨酸残基上的三甲基化修饰（Trimethylation of histone H3 at lysine 27,H3K27me3）同基因的转录抑制及兼性异染色质有关,而同一位点的乙酰化修饰（Acetylation of histone H3 at lysine 27,H3K27ac）同基因的转录激活及常染色质有关。这些修饰可通过影响染色质的结构或者影响其他转录因子与结构基因启动子的结合发挥基因转录调控作用。目前研究发现,在诸如糖尿病、神经退行性病变、癌症等疾病中,包括组蛋白H3K27me3和H3K27ac在内的表观遗传学修饰紊乱可引起关键基因的异常表达,在上述疾病的发生发展中发挥重要作用。然而,组蛋白H3K27me3和H3K27ac在糖尿病创面患者血清诱导血管内皮细胞生物学行为变化过程中是否起到了关键性作用,影响了哪些关键基因的表达,以及H3K27me3和H3K27ac修饰紊乱的相关基因是否与血清差异成分之间存在内在联系等问题目前尚不清楚。综上,本研究从临床出发,首先明确糖尿病创面患者和健康对照者血清中蛋白质的差异,随后使用人血清条件培养基孵育脐静脉内皮细胞,观察患者血清对血管内皮细胞凋亡、迁移和血管生成能力的影响,并进一步探索糖尿病创面患者血清对血管内皮细胞H3K27me3和H3K27ac修饰水平的影响,为糖尿病并发症的治疗提供一定的理论依据和实验基础。第1部分糖尿病创面患者血清蛋白质组学分析目的:分析糖尿病创面患者和健康对照者血清中蛋白质的差异。方法:收集糖尿病创面患者血清,以健康体检者血清作对照,采用串联质谱标签（Tandem mass tag,TMT）联合液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）技术筛选血清中差异表达蛋白,结合生物信息学分析,探索差异蛋白的主要功能、参与的信号通路以及蛋白互作网络;采用ELISA蛋白定量技术对差异蛋白进行验证;应用多重微球流式免疫荧光发光法测定血清中12项细胞因子的表达水平。结果:在糖尿病创面患者血清和健康对照者血清中共鉴定出173个差异蛋白质,包括100个上调蛋白质和73个下调蛋白质。生物信息学分析表明差异蛋白主要参与细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）-受体相互作用以及补体及凝血级联途径。结合ELISA验证,LRG1,CD5L,CRP,IGHA1和LBP在患者血清中上调,差异具有统计学意义（p＜0.05）。血清细胞因子分析结果发现与健康对照组相比,糖尿病创面患者血清中IL-6,IL-8和IL-12p70表达水平上调,IFN-α表达水平下调,差异具有统计学意义（p＜0.05）。结论:糖尿病创面患者血清中存在的差异蛋白可通过ECM-受体相互作用激活补体及凝血级联途径以及炎症反应,与糖尿病创面患者长期低度的全身炎症和血管内皮功能紊乱密切相关。第2部分糖尿病创面患者血清对血管内皮细胞生物学行为的影响目的:观察糖尿病创面患者血清对血管内皮细胞凋亡、迁移和血管生成能力的影响。方法:建立人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）的原代培养体系,利用CD31免疫荧光染色法进行细胞鉴定。在基础培养基中添加15%糖尿病创面患者或健康对照者血清配制成15%人血清条件培养基。HUVECs随机分为糖尿病创面血清组和健康对照血清组,用人血清条件培养基孵育HUVECs 48或72小时。应用流式细胞术检测患者血清对HUVECs细胞凋亡的影响;利用Transwell细胞迁移实验检测患者血清对HUVECs细胞迁移能力的影响;采用小管形成实验观察患者血清对HUVECs血管生成能力的影响;同时使用q RT-PCR技术检测患者血清对HUVECs中凋亡、血管生成、周期紊乱、衰老相关基因（EGFR,Bcl-2,VEGF,P21,P53）m RNA表达水平的影响。结果:经酶消法从脐静脉中分离培养HUVECs,经免疫荧光染色观察到细胞膜上弥漫强阳性表达CD31,证明所培养的细胞为HUVECs。与健康对照血清组相比,糖尿病创面患者血清组HUVECs细胞凋亡率明显增加,细胞的迁移和血管生成能力受到明显抑制,差异具有统计学意义（p＜0.05）。同时,q RT-PCR结果显示:与健康对照血清组相比,糖尿病创面患者血清组HUVECs细胞内EGFR,Bcl-2和VEGF的表达水平明显降低,P21和P53的表达水平显著升高,差异具有统计学意义（p＜0.05）。结论:糖尿病创面患者血清诱导血管内皮细胞关键基因表达异常,进而破坏内皮细胞稳态,诱导内皮功能障碍。第3部分组蛋白H3K27修饰在糖尿病创面患者血清诱导血管内皮细胞生物学行为变化的作用和分子机制目的:从组蛋白H3K27me3和H3K27ac修饰角度分析糖尿病创面患者血清诱导血管内皮细胞生物学行为变化的分子机制。方法:用人血清条件培养基孵育HUVECs 6小时,Western Blot检测细胞内H3K27me3和H3K27ac的整体表达水平;染色质免疫共沉淀测序技术（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing,ChIP-Seq）检测H3K27me3和H3K27ac在全基因组区域的富集程度和分布状态;ChIP-q PCR验证组蛋白H3K27me3在EGFR基因启动子区域的富集水平。结果:与健康对照血清组相比,糖尿病创面患者血清组HUVECs内H3K27me3的整体表达水平降低,H3K27ac的表达水平升高,表明这两种组蛋白修饰在糖尿病创面患者血清孵育的HUVECs中修饰紊乱。ChIP-seq分析结果表明这2种组蛋白修饰主要分布在基因组TSS区域,提示其主要参与基因转录调控,我们发现H3K27me3在EGFR和TNXB基因启动子区域显著富集,在TLR5和RTEN基因启动子区域富集明显减少;H3K27ac在P21,VDAC1,ADAMTS1以及EFEMP1基因组功能区域显著富集,在PLXDC2基因组功能区域富集明显减少,这些基因与血管内皮细胞的生物学行为紧密相关。ChIP-q PCR结果显示:与健康对照血清组相比,糖尿病创面血清组HUVECs细胞内的H3K27me3在EGFR基因启动子区的富集水平明显升高,差异具有统计学意义（p＜0.05）。结论:糖尿病创面患者血清诱导血管内皮细胞组蛋白H3K27me3和H3K27ac修饰紊乱,导致关键基因转录异常,在内皮细胞凋亡、迁移和血管生成能力等生物学行为变化中起重要作用。