1研究背景手足口病是肠道病毒引起的常见传染病之一,其病原体主要有两种:柯萨奇病毒 A组 16型(Coxsackie virus A16,CoxA16)和肠道病毒 71 型(Enterovirus 71,EV71)。该病多发生于5岁以下的儿童,引起发热和手、足、口等部位的皮疹、溃疡,个别重症患者可出现心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命性并发症。其中,EV71是引起重症的主要病原体。手足口病疫情暴发,常有EV71感染引起手足口病重症和死亡的报道,对公共健康安全造成了巨大的威胁。EV71重症感染主要表现为无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等神经系统并发症,而中枢神经系统感染导致的肺水肿、肺出血和心肌炎,使其致残和病死率较高。2007年-2008年全国出现大范围手足口病疫情。本课题组对一例EV71病毒感染死亡患儿进行了临床、病原学及病理学等方面的研究。结果显示,EV71可引起播散性感染,累及多组织器官,而肺水肿、出血是死亡的主要原因。中枢神经系统的病理学观察可见大脑组织炎症改变,而小脑和脑干炎症改变不明显,免疫组化检测结果显示EV71病毒主要分布在大脑胶质细胞,小脑颗粒细胞及脑干神经元细胞,提示脑组织的多种神经细胞是EV71的主要攻击对象。许多研究指出,EV71的致病性受多种因素的调节,但其致病机理目前尚未有确切的认识。阐明EV71的致病机理,对EV71感染的预防与控制有着重要的意义。2研究目的(1)分析EV71感染的BALB/c小鼠机体损伤情况及病毒在组织中的分布,初步探讨EV71可能的致病机理。(2)探讨EV71损伤Vero细胞的机制。3研究方法本研究采用的EV71来自本课题组于2008年一手足口病死亡病例标本中分离的EV71临床分离株,序列号888/GZ/CHN/2008,研究方法如下:(1)用Reed-Muench法计算病毒液的半数组织细胞感染量(median tissue culture infective dose,TCID50),判定病毒滴度。(2)应用免疫荧光方法,用EV71 VP1蛋白单克隆抗体标记EV71在感染Vero细胞中的定位。(3)透射电子显微镜下观察EV71感染的Vero细胞超微结构。(4)用EV71 888/GZ/CHN/2008临床分离株攻击5日龄BALB/c小鼠,观察小鼠发病过程和临床表现,观察全身脏器组织病理变化,通过免疫组织化学方法研究病毒抗原在小鼠体内的分布。(5)通过显色原位杂交技术及透射电镜观察研究EV71对小鼠肌肉组织的损伤。(6)用体视学原理和方法,对EV71感染Vero细胞中的病毒颗粒及线粒体进行定量测试和分析。4结果(1)该 EV71临床分离株的 TCID50为 10-5.81/0.1 ml。(2)普通光镜观察可见EV71感染的Vero细胞变圆、皱缩、脱落。EV71抗原的免疫荧光检测显示EV71存在于感染细胞的胞浆中,而胞核无EV71抗原的表达。超微结构显示Vero细胞胞浆中存在大量呈团分布、晶格状排列的大小一致的高电子密度病毒颗粒,而细胞核内未见病毒颗粒。胞质中,线粒体损伤显著,表现为线粒体嵴崩解断裂,线粒体空泡化。(3)5日龄BALB/c小鼠腹腔接种EV71临床分离株,组织学检查显示感染小鼠骨骼肌组织坏死、断裂。免疫组织化学及显色原位杂交检测均证明了病变骨骼肌组织中有大量的病毒。除了 4只EV71感染小鼠外,其余感染小鼠脑组织中见散在炎细胞,但无实质性损失,免疫组化亦未检测到病毒的表达。心肌不同于损伤显著的骨骼肌,心肌未见EV71侵犯、破坏。肺组织出血、水肿,其它组织脏器亦未见异常。(4)透射电镜下分别观察EV71感染的BALB/c小鼠骨骼肌及Vero细胞,可见细胞中线粒体呈空泡化。在Vero细胞呈空泡化的线粒体中可见与线粒体外病毒颗粒形状、大小一致的高电子密度颗粒,定量分析结果与线粒体外病毒颗粒体视学参数结果基本相符。5结论(1)EV71临床分离株感染BALB/c小鼠,骨骼肌是其主要作用靶标。EV71不但损伤小鼠肢体骨骼肌,还损伤肋间肌、椎管旁肌肉组织。(2)线粒体可能是EV71的直接损伤靶点。在Vero细胞中,EV71能进入线粒体对线粒体的结构与功能造成直接的损伤。