鸭疫里默氏杆菌TonB依赖性受体RhuR的功能研究

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鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)为黄杆菌目(Flavobacteriales)的革兰氏阴性菌,主要感染鸭等禽类,引发浆膜炎、败血症等症状。鸭疫里默氏杆菌的生存需要血红素和血红蛋白作为营养物质,但是关于鸭疫里默氏杆菌对血红素转运机制的研究尚少。本研究将RA-CH-1株的B739_1416鉴定为一种TonB2依赖性的血红素受体,并将其命名为Rhu R(Riemerella heme uptake receptor),实验结果如下:RA-CH-1 rhu R基因在铁限制性GCB中转录上调80倍;同时在fur缺失株中转录上调120倍;并且序列分析结果显示,rhu R基因的启动子区域包含一段RA典型的Fur-box序列。以上结果表明rhu R基因的转录受铁离子的调控且由Fur介导。将RA-CH-1 rhu R基因缺失后,发现缺失株在添加0.3μM血红蛋白的铁限制培养基中生长差于亲本株,表明rhu R参与RA-CH-1对血红素的利用。PCR扩增rhu R基因序列1050位至2058位的目的片段,克隆至p ET32a,原核表达并纯化出重组蛋白r Rhu RC。体外血红素结合实验结果表明重组蛋白r Rhu RC具有结合血红素的能力。同时研究发现,rhu R缺失株全细菌结合血红素的量相较于亲本株降低,进一步表明Rhu R具有结合血红素的能力。为确定Rhu R对血红素的转运依赖于TonB系统,成功构建ton B1 rhu R双缺株和ton B2 rhu R双缺株,评估双缺株对血红素利用的情况。结果显示rhu Rton B2双缺失株与ton B2缺失株在添加0.3μM血红蛋白的铁限制培养基中生长没有任何差异。以上结果表明,Rhu R的功能依赖于TonB2复合物。将等量的亲本株和缺失株感染3日龄雏鸭,发现缺失株的毒力和定殖水平与亲本株基本一致。以上结果表明rhu R基因缺失后并未影响RA-CH-1的毒力和定殖能力。
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