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恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)UW4是典型的植物促生根际细菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR),能够产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid,ACC)脱氨酶(ACC deaminase,Acd S),通过利用植物合成的乙烯前体物ACC,减少乙烯的合成量,降低乙烯对植物生长的抑制作用,从而促进植物的生长发育。ACC是否影响PGPR在植物根际的定殖,尚未见报道。本课题对恶臭假单胞菌UW4及其Acd S突变株UW4 AcdS~—进行荧光标记,比较了该二菌株在小麦根际的定殖情况,并对其机理进行了探讨。主要结果如下:1、基于三亲本杂交的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体p BBRGFP的构建。非接合型质粒pBBR1MCS2含有接合转移所需的mob基因,利用限制性内切酶EcoRI、Hind III将pBBR1MCS2质粒线性化,得到5132 bp的线性化载体片段。以绿色荧光质粒pGFPuv为模板,PCR克隆得到由lacZ启动子控制的GFP基因表达盒的目的片段(1094 bp),该片段的两端带有能够与线性化pBBR1MCS2载体互补配对的30个碱基序列。利用特殊的重组酶,将目的片段定向重组至载体上,得到了能够被接合型质粒(辅助质粒)引发转移的表达绿色蛋白的重组质粒pBBRGFP。2、三亲本杂交法构建恶臭假单胞菌荧光标记菌株。以携带荧光质粒pBBRGFP的E.coli DH5α菌株为供体菌株,以携带辅助质粒pRK2013的E.coli DH5α为辅助菌株,以恶臭假单胞菌UW4或UW4 AcdS~-为受体菌株,通过三亲本杂交,得到了能够发出荧光的转化子,分别命名为恶臭假单胞菌UW4-G和UW4 AcdS~--G。转化子经PCR验证,能够克隆得到gfp基因及含lacZ的gfp片段;同时,从UW4-G和UW4 AcdS~--G转化子分别克隆得到了AcdS基因及四环素抗性基因tet基因插入突变的AcdS片段。表明恶臭假单胞菌荧光标记菌株已成功构建。3、恶臭假单胞菌荧光标记菌株的质粒稳定性和生长速率。在无选择压力条件下,连续传代液体培养125 h,UW4-G和UW4 AcdS~--G菌株中的绿色荧光质粒均表现为100%的稳定性。在无选择压力条件下,四个菌株UW4、UW4 AcdS~-、UW4-G和UW4 AcdS~--G的生长曲线比较,荧光标记菌株比其出发菌株生长速度略有滞后。4、恶臭假单胞菌荧光标记菌株对ACC的趋化和在小麦根际的定殖。四个菌株UW4、UW4-G、UW4 AcdS~-和UW4 AcdS~--G对精氨酸和琥珀酸表现出相同的趋化性,然而,UW4和UW4-G对ACC表现为强的趋化性,而UW4 AcdS~-和UW4 AcdS~--G对ACC没有趋化作用。小麦种子用3 mM的ACC、精氨酸或琥珀酸浸种后,盆栽,每粒种子接种UW4-G或UW4AcdS~--G菌剂10~8 cfu,培养15 d,测定根际定殖的菌数和小麦生物量。没用趋化物浸种仅接种UW4-G的小麦,根际定殖的细菌数和发绿色荧光的细菌数均最高,比空白对照(不用趋化物浸种、未接菌剂)分别提高178.63%(p<0.01)和214.74%(p<0.01);小麦株高和株重,比空白对照分别提高17.04%(p<0.01)和27.85%(p<0.05)。用ACC浸种并接种UW4-G的小麦根重、株高和株重,比空白对照分别提高127.58%(p<0.01)、23.11%(p<0.01)和41.93%(p<0.01)。用精氨酸或琥珀酸浸种并接种UW4-G的小麦生长指标与空白对照没有差异。用ACC、琥珀酸或精氨酸浸种并接种UW4 AcdS~--G的小麦,小麦各生长指标与空白对照没有差异。以上结果表明,恶臭假单胞菌UW4在植物根际的定殖和促生作用,与其对ACC的趋化性密切相关。