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青光眼是一类致盲率高、治疗较困难的眼病。在药物无法控制眼压时,治疗青光眼最为有效的方法是滤过性手术,而术后切口的瘢痕化往往导致滤过术的失败。术后瘢痕的抑制的方法有药物抑制(皮质类固醇、抗代谢药物、抗凝血药物)和基因干扰(对生长因子和细胞因子的调节)。其中丝裂霉素C(MMC)为公认的抑制瘢痕形成的临床药物,但MMC有细胞非特异性,代谢周期的缺点。采用基因治疗对瘢痕调控,也是种有效手段,但裸露的DNA或siRNA在体内外都容易降解。
天然或合成的高分子聚合物,包括壳聚糖(CS),透明质酸,环糊精,聚酯和聚醚酯,血脂,磷脂己被用于制定药物纳米颗粒,纳米囊,乳剂和悬液。CS是一种天然阳离子多糖,并已广泛应用于眼科给药系统。角膜和眼结膜表面的粘蛋白所带的负电荷与CS的正电荷之间的静电引力可以作为推动力,促进CS作为药物载体的吸收。此外,CS还具有黏膜上皮细胞的穿透性,低毒,可生物降解性(泪液中的溶菌酶是450～1230 mg/L)和抗菌活性,假塑性和粘弹性能。
本报告分别从药物治疗和siRNA干扰载体的设计与应用进行了初步的研究。
(一)CS-g-MMC缀合物的设计合成与应用论文设计以4.0×104 g/mol壳聚糖为原料,采用KIO4氧化(醛化度为31.52％),再与丝裂霉素(n[CS-CHO]:n[MMC]=1:5,1:12.5,1:25)进行希夫碱反应,合成了系列壳聚糖-丝裂霉素缀合物(CS-g-MMC5-25)。通过红外光谱(IR),核磁共振光谱(1H NMR)和凝胶色谱分析(GPC)表征了产物的结构。在pH值为7.40的PBS溶液里,缀合物稳定存在;降低体系的pH值有助于MMC的缓释;加入107U/L溶菌酶也有助于MMC从缀合物CS-g-MMC中释放。缀合物CS-g-MMC体外抑制对人Tenon囊成纤维细胞(HTCFs)增殖的实验表明:CS-g-MMC可持久并缓慢增强地诱导成纤维细胞的早期凋亡,对成纤维细胞DNA合成有抑制作用,能够控制成纤维细胞向肌成纤维细胞的表型转化,降低瘢痕组织的收缩程度,使细胞迁移能力下降。而且这种作用比单药MM C和MMC/CS-CHO复合药都要强。
(二)CS-g-PEI可降解siRNA载体的设计合成与应用聚乙烯亚胺(PEI)被认为是最有效的基因传递的阳离子聚合物。因为阳离子聚合物与带负电荷的DNA或siRNA相互静电作用形成复合物,使基因更容易通过细胞膜运输,并保护DNA或siRNA抵御核酸酶的消化作用。然而,PEI也有细胞毒性,非生物降解的缺点。
以CS接枝小分子PEI已有很多文献报道,但如何提高PEI的接枝效率,CS和PEI的分子量以及PEI的接枝率等对其作为基因或siRNA载体转染效率的影响如何,并未见报道。本文以简单的醛化CS为原料,首先研究影响PEI接枝率的各种因素,合成系列不同PEI、CS分子量及不同接枝率的CS-g-PEI共聚物,并研究这些共聚物对siRNA的复合效率、粒径、表面点位、细胞毒性、体外转染效率的影响。由于时间限制,初步得到如下结果:
CS的醛化度主要由KIO4的量控制,KIO4越多,反应时间越长,CS的醛化度越高,最高可达74.02％,CS的分子量越大这种规律越明显。
PEI接枝CS-CHO的接枝率也主要由[PEI]/[CS-CHO]的摩尔比决定,当n[PEI]/n[CS-CHO]=4:1时,CS42K-g-PEI600接枝率可达11.8％。低分子量CS-CHO有利于接枝聚合,PEI的分子量越大接枝率越高(由PEI分子量决定)。
CS-g-PEI与siRNA复合实验表明,CS-g-PEI能有效复合siRNA形成粒径100nm左右表面带正电的纳米离子。随着N/P增加,CS-g-PEI/siRNA复合物的粒径减小,zeta电位增加;CS-g-PEI的总分子量接近时,PEI接枝率越高,形成纳米粒子的粒径越小。