【摘 要】
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本研究以猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）基于氨基肽酶N（aminopeptidase,APN）的受体结合区（receptor binding domain,RBD）为研究对象,通过与国内其他典型毒株RBD基因进行进化分析,筛选流行毒株R
【基金项目】
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国家重点研发计划子课题（2021YFD1801103-6）；
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本研究以猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）基于氨基肽酶N（aminopeptidase,APN）的受体结合区（receptor binding domain,RBD）为研究对象,通过与国内其他典型毒株RBD基因进行进化分析,筛选流行毒株RBD,构建基于RBD的候选疫苗,分析其对小鼠和仔猪的免疫原性。本研究合成PEDV和TGEV RBD基因,利用哺乳动物表达系统表达获得重组蛋白并制备小鼠多克隆抗体。建立了PEDV和TGEV抗体间接ELISA方法。利用杆状病毒表达系统获得重组蛋白并进行小鼠和仔猪的免疫原性分析。获得以下研究结果:1.利用哺乳动物表达系统,成功构建了pc DNA3.4-PER、pc DNA3.4-TGR重组质粒,并获得重组蛋白,成功制备小鼠多克隆抗体。将筛选的RBD基因进行密码子优化,加入strep-Ⅱ标签,成功构建至pc DNA3.4载体中,将重组质粒转染至293F悬浮细胞中进行表达,获得重组蛋白。将50μg蛋白配合弗式佐剂免疫BALB/c小鼠,成功获得多克隆抗体,PEDV多克隆抗体效价达1:204 800,TGEV抗体效价为1:12 800。2.成功建立PEDV抗体间接ELISA方法,抗原包被浓度为5μg/m L,封闭液为5%脱脂乳-TBST,封闭条件为37℃,1 h,待检血清稀释度为1:400,反应条件为37℃,30 min,酶标二抗稀释度为1:8 000,反应条件为37℃,30 min,底物反应时间为37℃,15 min,确定阴阳性临界值为0.053;成功建立TGEV抗体间接ELISA方法,抗原包被浓度为10μg/m L,封闭液为5%脱脂乳-TBST,封闭条件为37℃,1 h,待检血清稀释度为1:400,反应条件为37℃,40 min,酶标二抗稀释度为1:5 000,反应条件为37℃,40 min,底物反应时间为37℃,20 min,确定阴阳性临界值为0.115。3.利用杆状病毒表达系统,成功构建p FBD-PER、p FBD-TGR重组质粒,并获得重组蛋白,利用浓缩的重组蛋白免疫小鼠和仔猪,分析其免疫原性。将筛选的RBD基因进行密码子优化,加入strep-Ⅱ标签,成功构建至p Fast Bac?Dual载体中,将重组质粒转化至DH10Bac?大肠杆菌感受态中,经蓝白斑筛选获得重组杆粒,将重组杆粒转染至SF9贴壁细胞中拯救重组杆状病毒,5-7天后获得细胞培养物上清为P1代重组杆状病毒。P1代重组杆状病毒感染SF9贴壁细胞至P3代,经间接免疫荧光法测定重组杆状病毒滴度。经Western blot和间接免疫荧光法鉴定蛋白表达,优化P3代重组杆状病毒感染悬浮SF9细胞的感染复数和收获时间。按照最佳表达条件进行表达,低速离心收集细胞培养物上清后超速离心浓缩纯化重组蛋白,蛋白定量后免疫小鼠和仔猪:将利用杆状病毒表达系统制备的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,并设置空载体对照和PBS对照,实验结果表明免疫组小鼠特异性抗体和中和抗体显著高于对照组。首次免疫第8周后分离小鼠脾淋巴细胞,染色后经流式细胞术分析,结果表明:PER蛋白组的CD3+CD4+双阳性T淋巴细胞略高于空载体对照组,显著高于PBS组;而TGR蛋白组的CD3+CD4+双阳性T淋巴细胞显著高于PBS组和空载体对照组,表明PER蛋白和TGR蛋白能有效激发小鼠的体液免疫和细胞免疫。将PER蛋白免疫仔猪,并设置空载体对照组和佐剂对照组,实验结果表明免疫组仔猪特异性抗体和中和抗体显著高于对照组。首次免疫后第32天分离仔猪外周血淋巴细胞,染色后经流式细胞术分析,结果表明:PER蛋白组的CD3+CD4+双阳性T淋巴细胞水平略高于空载体对照组,显著性高于佐剂对照组。表明PER蛋白能够有效激发仔猪的体液免疫和细胞免疫。
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