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背景:亨廷顿疾病（Huntington’s Disease,HD）是一种具有神经退行性的常染色体显性遗传类疾病,其最明显的临床症状是患者出现不自主舞蹈样动作,故该疾病也被称为亨廷顿舞蹈症。研究表明,HD具有年龄依赖性特征,即随着年龄增加HD患者的病情会逐渐加重直至死亡。目前认为人类HD致病原因是其4号常染色体上的亨廷顿基因（Htt）外显子1发生了CAG序列的异常突变加长,导致正常亨廷顿蛋白的错误折叠形成亨廷顿突变蛋白（mutant Huntingtin,mHtt）,细胞无法将mHtt完全清除,当mHtt累积聚集到一定程度后,会造成脑部纹状体神经元细胞变性和脑组织萎缩坏死。一般而言,CAG异常突变的长度越长,HD的发病年龄越早,疾病表型也会越严重。现在常用的HD小鼠模型主要有以下三种:1)采取基因敲除方式靶向破坏致病基因的“敲除小鼠模型”;2)通过外源基因或启动子的引入,条件过表达mHtt突变蛋白的N末端或者过表达全长突变蛋白的“转基因小鼠模型”;3)仅在小鼠自身内源性启动子调控下改变内源基因的“敲入小鼠模型”。目前,随着CRISPR/Cas9等新兴基因编辑技术的快速发展,研究人员在构建不同HD模型时有了更多可选择性,为疾病药物筛选和新型药物开发提供了新平台。目的:在不添加外源基因（或外源启动子）仅改变特定内源性基因的条件下,利用CRISPR/Cas9技术在小鼠Htt基因的外显子1（Exon 1）内敲入150Q,构建HD原位敲入小鼠疾病模型。方法:（1）根据NCBI中收录的C57BL/6J小鼠Htt基因信息进行分析,设计Cas9/gRNA靶点序列,通过制备体外转录gRNA和酶切DNA来检测Cas9/gRNA的体外酶切活性,挑选出活性较好的L端和R端gRNA靶点进行配对。（2）参考Htt基因信息和gRNA靶点序列对的活性位置,设计150Q Donor质粒。（3）将Cas9mRNA、gRNA、150Q Donor DNA等组分进行显微注射到受精卵中,然后将胚胎移植到受体雌鼠体内待产。（4）在F0代小鼠出生后,鉴定其基因型,挑选F0代杂合子小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠,经F1代基因型鉴定后,将F1代杂合子小鼠与野生型小鼠交配得到F2代小鼠,之后,再将基因型正确的F2代杂合子小鼠进行相互交配,希望能在F3代小鼠中培育出纯合子小鼠。（5）分别对9个月、5个月、2个月的150Q杂合子小鼠(HD150Q/7Q)和同窝正常7Q小鼠(HD7Q/7Q)的大脑、小脑、脑干、肝脏、肾脏、肺部、心脏、脾脏等部位的RNA进行提取,并检测其RNA是否有150Q（或7Q）转录。（6）分别提取了9个月、5个月、2个月的HD150Q/7Q小鼠和HD7Q/7Q小鼠的大脑、小脑、脑干、肝脏、肾脏、肺部、心脏、脾脏等部位的蛋白,并对其进行了三种蛋白抗体——Htt总蛋白（MAB2166,Millipore）、Htt加长polyQ突变蛋白（MAB1574,Millipore）以及内参蛋白β-actin（13E5,Cell Signaling Technology）的检测。结果:（1）一共设计了20个gRNA靶点序列,经过体外Cas9酶切活性检测,最终选择活性较高的Htt-L9靶点和Htt-R9靶点,构建了9号gRNA靶点序列对。（2）经3次显微注射和胚胎移植后,最终成功出生6只F0代小鼠,其中2只基因型正确,其均为杂合子雄鼠。（3）截至2018年11月17日,子代（F1代、F2代、F3代）小鼠共出生118只,其中有38只雄鼠和31只雌鼠基因型正确,均为杂合子,子代无纯合子小鼠。（4）因为构建的150Q模型小鼠为杂合子(HD150Q/7Q),故HD150Q/7Q的各组织RNA均有150Q和7Q的同时转录;而正常小鼠(HD7Q/7Q)的各组织RNA只有7Q转录。（5）在内参蛋白β-actin表达水平一致的情况下,Htt总蛋白（MAB2166,Millipore）在HD150Q/7Q小鼠和HD7Q/7Q小鼠的各组织均有表达,但Htt加长polyQ突变蛋白（MAB1574,Millipore）仅在HD150Q/7Q小鼠的组织中检测到。结论:利用CRISPR/Cas9技术在小鼠Htt基因的外显子1上运用了同源重组方法,将7Q替换为150Q,经过小鼠基因组DNA鉴定、RNA转录情况及相关蛋白表达情况的结果分析表明,本课题完成了对150Q原位敲入小鼠HD模型的构建,成功获得了杂合子小鼠(HD150Q/7Q)。可能因为HD疾病本身具有年龄迟发性作用,且我们构建的原位敲入模型小鼠为杂合子,所以150Q小鼠现在还没有表现出明显HD疾病表征。另外,也对小鼠进行了体重检测与活动情况分析,但未发现杂合子小鼠(HD150Q/7Q)与正常小鼠(HD7Q/7Q)之间存在显著性差异。