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目的骨质疏松是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者的常见并发症,是导致CKD患者骨折、病残率和死亡率增加的重要危险因素。一般认为当GFR<60 ml/min时,75%-100%的患者会出现一定程度的骨质疏松。流行病学研究发现CKD患者骨折风险是非CKD人群的4.4-14倍。大量证据表明CKD骨质疏松与骨髓脂肪组织增多有关。最新研究发现,一定条件下内皮细胞可发生内皮-间充质转分化(endothelial-to-mesenchymal transition,End MT),可进一步分化为脂肪细胞,故内皮-脂肪细胞转分化可能是CKD骨质疏松发生的新机制。西那卡塞(cinacalcet,CINA)是临床常用的治疗CKD甲状旁腺功能亢进症(secondary hyperparathyroidism,SHPT)的药物,能显著降低血清甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)水平。最新研究发现CINA还能改善CKD患者骨质疏松,但是具体机制仍不十分清楚。因此本研究旨在探究CINA改善CKD骨质疏松的机制,并着重探讨其对内皮-脂肪细胞转分化的影响,为临床防治CKD骨质疏松提供理论依据。方法本研究共分为两部分组成。第一部分为体内实验,第二部分为体外试验。第一部分,研究CINA对CKD大鼠骨质疏松的影响。8周SD大鼠分为三组:对照组,CKD组,CKD+CINA组。0.75%腺嘌呤和高磷(1.5%)饮食构造CKD大鼠模型,大鼠42周龄时处死。大鼠处死前进行动物双能X线骨密度检测和小动物micro-CT检测;处死后收集血和骨组织标本,用于血生化和相关骨骼代谢相关参数分析(包括骨骼力学检测、HE染色和油红O染色)。Western blot检测骨髓内皮细胞标记物CD31、间充质细胞标记物(α-SMA和FSP1)、间充质干细胞标记物(CD10和CD44)、脂肪细胞标记物(PPAR-γ和C/EBP-α)蛋白表达;骨髓组织切片行CD31和FSP1,CD31和CD44的免疫荧光共染。第二部分,探索PTH对内皮-脂肪细胞转分化的影响,及经典Wnt/β-catenin信号通路在其中的作用。体外培养主动脉内皮细胞,使用Western印迹和免疫荧光观察不同浓度及时间PTH干预对内皮细胞End MT相关标记物的变化(CD31、FSP1和α-SMA)和核转录β-catenin的表达变化;继而脂肪细胞培养基诱导分化一周,Western印迹和油红O染色检测脂肪细胞标记物(PPAR-γ和C/EBP-α)表达及脂滴形成;使用β-catenin si RNA和DKK1阻断经典Wnt/β-catenin信号通路,检测PTH干预对内皮细胞End MT相关标记物及进一步成脂分化的影响。结果第一部分实验结果显示:与对照组比较,CKD组大鼠血肌酐、磷、PTH水平显著升高,血钙降低;CKD组大鼠腰椎和股骨骨密度较对照组下降;micro-CT结果显示,CKD组大鼠股骨松质骨和皮质骨与对照组相比骨量丢失明显;骨骼力学检测结果发现,CKD大鼠力学特性较对照组减弱,表现为极限载荷、能量、刚度和弹性模量下降;骨组织HE及油红O染色提示,CKD组较对照组骨髓脂肪组织含量增加。CINA治疗能显著降低CKD组大鼠血清PTH水平、提高骨密度、减少松质骨和皮质骨的骨丢失、增加骨骼力学特征、降低骨髓脂肪组织浸润。此外,CKD组大鼠骨髓End MT相关标记物蛋白水平较对照组显著升高,CINA治疗后,上述End MT相关指标表达明显下调。大鼠血清PTH水平与骨髓End MT相关蛋白表达水平具有显著相关性。第二部分试验结果显示:PTH呈浓度和时间依赖方式降低CD31蛋白表达,增加FSP1和α-SMA蛋白表达。免疫荧光结果显示:随着PTH干预浓度的提高及时间延长,内皮细胞胞浆大量表达FSP1,并伴随CD31表达减少。继续脂肪细胞培养基诱导分化一周后,PTH干预组PPAR-γ和C/EBP-α表达水平显著高于对照组,油红O染色阳性;此外,PTH呈浓度依赖性增加核转录β-catenin表达水平;DKK1及β-catenin si RNA干预细胞能显著下调PTH诱导的End MT相关标记物及诱导成脂后PPAR-γ和C/EBP-α的表达。结论1.CINA治疗能降低CKD大鼠血清PTH水平,减少骨髓脂肪组织形成,改善骨质疏松。2.CINA抑制骨髓内皮End MT;3.PTH能通过激活Wnt/β信号通路促进内皮细胞发生End MT并进一步分化为脂肪细胞。PTH诱导的内皮-脂肪细胞转分化可能是CKD骨质疏松新机制;4.CINA可能通过抑制PTH释放,降低骨髓内皮-脂肪细胞转分化,减少骨髓脂肪细胞浸润,从而抑制CKD骨质疏松的发生发展。