目的独活寄生汤是治疗类风湿性关节炎的复方制剂,其治疗效果已得到了很多临床应用的证实。本课题组前期通过大鼠体内药代动力学研究,发现经独活寄生汤灌胃后,多种成分在大鼠体内血药浓度较高。本研究旨在通过网络药理学的分析,以及实验研究独活寄生汤对CIA大鼠的治疗作用和方中多种入血成分的抗炎活性,揭示独活寄生汤治疗类风湿性关节炎的作用机制及挖掘潜在的抗炎药物。方法1、运用网络药理学的分析方法,通过TCMSP和GeneCards数据库查找独活寄生汤的有效成分靶点和类风湿性关节炎的靶点,得到成分和疾病的共同靶点,构建PPI网络图,并进行GO和KEGG富集分析,从而推测独活寄生汤治疗类风湿性关节炎的关键靶点和作用机制;2、构建CIA模型大鼠,以甲氨蝶呤为阳性对照,观察独活寄生汤对CIA大鼠的治疗效果;3、利用LPS刺激RAW264.7构建细胞炎症模型,MTT法检测独活寄生汤中八种入血成分的细胞毒性,Griess法测定NO的释放量,采用Q-PCR检测炎症相关因子TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS的相对表达量,筛选出抗炎活性较显著的成分;4、蛋白免疫印迹法检测抗炎活性化合物对炎症细胞TNF-α、STAT3和p-STAT3等相关蛋白表达量的影响,推测其可能的作用机制。结果1、网络药理学结果显示:独活寄生汤治疗类风湿性关节炎的关键靶点有46个,包括TNF、IL-6、IL-1B、STAT3、NOS2等。经GO功能分析得到391项生物功能、33项细胞组成和76项分子功能,提示独活寄生汤通过多种途径发挥作用。KEGG分析获得97条相关通路,包括TNF信号通路、JAK-STAT信号通路等,提示独活寄生汤可能通过TNF、STAT3等核心靶点,进而影响相关信号通路,从而发挥治疗类风湿性关节炎的作用。分子对接显示,多种有效成分与核心靶点TNF-α有较强的结合能力。2、通过整体动物实验发现,独活寄生汤能有效降低CIA模型大鼠的关节炎肿胀程度,改善踝关节滑膜组织病理变化,一定程度上能有效治疗类风湿性关节炎;3、进一步的细胞实验发现,独活寄生汤中八个入血成分有不同程度的抗炎活性。其中异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯和异补骨脂素能显著降低炎症细胞TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS等基因的相对表达量,同时抑制炎症细胞NO的释放。4、WB实验结果显示,异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯、异补骨脂素能降低炎症细胞TNF-α蛋白的表达水平。异补骨脂素和二氢欧山芹醇当归酸酯还能降低炎症细胞p-STAT3蛋白的表达水平,显示两种成分可能通过干预STAT3信号通路发挥抗炎作用。而异欧前胡素对炎症细胞的p-STAT3蛋白表达无明显的影响。结论独活寄生汤中有效成分可能通过作用于TNF、IL-6、IL-1β、STAT3等靶点,影响TNF等信号通路发挥治疗类风湿性关节炎的作用。独活寄生汤能明显改善CIA模型大鼠的关节炎症状,在一定程度上能治疗类风湿性关节炎。体外细胞实验初步显示异补骨脂素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯等多种入血成分有一定的抗炎活性,是独活寄生汤发挥治疗类风湿性关节炎的关键成分。