运用RAPD分子指纹技术筛选屎肠球菌生产菌株的分子标记

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屎肠球菌(Enterococcus faecium)是人及动物肠道中正常菌群,属于肠球菌属,为圆形或椭圆形,呈单在、成双或成链排列的革兰氏阳性球菌,无芽孢,无鞭毛,产乳酸,因此归属于乳酸菌。近年来的研究发现,屎肠球菌具有调节宿主的肠道健康和抗病、促生长作用,能调节肠道菌群平衡、抑制肠致病菌的感染以及增强宿主免疫力。屎肠球菌已经被美国、中国和欧盟列为允许使用的饲料添加剂。由于屎肠球菌在使用过程中需用活菌,并且在饲料中保持一定的活力,这就使得它很容易从产品中分离出来,被人仿冒和利用,导致屎肠球菌生产菌株知识产权得不到有效的保护。因此,本课题拟对屎肠球菌生产菌株、标准菌株和其它收集到的菌株进行RAPD指纹分析,筛选出多态性最高的随机引物,然后再与从全国各地健康猪体内分离的分离菌株进行分析,希望能筛选出生产菌株不同于现已报道的所有菌株的多态性图谱作为生产菌株的特殊标记,申报专利,为生产菌株知识产权的保护提供技术支持,获得了如下结果:(1)屎肠球菌的分离和鉴定本试验采集了不同省份、不同猪场的猪粪样品。通过菌落和菌株形态的观察、革兰氏染色、16S rRNA序列的扩增和屎肠球菌特异性片段ddl E.faecium的扩增,分离得到了76株屎肠球菌。并对实验室保存的菌株进行了重新的鉴定。(2)屎肠球菌RAPD分析随机引物的筛选本实验选择了20条引物,分别对生产菌株、标准菌株等6个屎肠球菌菌株进行RAPD指纹分析,以筛选出能使TC3出现不同于其它菌株的多态性图谱的随机引物。结果,用引物S4扩增的多态性图谱,条带多、清晰;6个被试菌株条带的数目、条带的位置以及泳动的距离均不相同,利用此引物扩增,得到了生产菌株TC3不同于其它菌株的特异性图谱,能够明显区分出生产菌TC3和其它五株菌之间的区别。(3)屎肠球菌分离菌株的RAPD分析对来自全国各地的76个屎肠球菌分离菌株进行了RAPD分析,发现用随机引物S4所获得的生产菌株的多态性图谱与其它所有被试菌株多态性图谱存在明显差异,可作为TC3生产菌株的特异性分子标记,能为屎肠球菌生产菌株知识产权的保护提供技术支持。
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