研究目的：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年人最常见的神经变性性疾病,临床特征为隐袭起病,进行性智能衰退、认知障碍和行为异常,多伴有人格改变,症状持续进展,病程通常为5-10年。在AD的发病机制研究中,研究最多的是神经细胞凋亡途径,而最常见的致凋亡因素是老年炎性斑(Senile plaque, SP)的主要成分p-淀粉样蛋白(Ap),尤其是容易发生聚集且难溶解的Aβ1-42。Aβ的神经毒性机制非常复杂,Aβ可诱发过度氧化应激,而过度的氧化应激导致自由基的产生与消除之间的动态平衡被打破,这一平衡打破加速了细胞的凋亡最终导致细胞死亡。氧自由基的增加可使细胞膜系统的脂质和蛋白被氧化修饰,活性氧增加,线粒体功能、ATP酶活性下降,从而导致细胞内ATP的降低。而细胞内ATP水平低于某一临界值时,ATP敏感性钾通道(KATP)被激活,其激活后可通过降低细胞的兴奋性来维持Na+和Ca2+的稳定以及保持ATP的水平,且已经有研究证明对ATP较敏感的KATP通道亚基是Kir6.2及SUR1亚基。核转录因子NF-κB是一种普遍存在的核转录因子,在中枢神经系统中也广泛表达,并参与神经系统中多种基因调控、细胞凋亡的信号传导过程。p38MAPK是分裂原激活的蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinase, MAPK)的成员之一,而MAPK通路是细胞外信号引起细胞核反应的汇聚通路。蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)是一组具有单一肽链结构的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,是机体细胞信号传导通路的中心环节,广泛分布于中枢神经系统。这三种信号通道与AD的发生发展有着密切的不可分割的联系。本实验通过研究NF-κB、p38MAPK和PKC信号通路对KATP通道亚基Kir6.2/SUR1蛋白表达的影响,来探讨这三个通路在阿尔茨海默病中的可能作用。为NF-κB、P38MAPK及PKC信号通路对神经元的作用提供了新思路,同时也为研究防治AD药物提供了新视角。研究方法：取Wistar大乳鼠(出生24h内),原代培养皮层和海马胆碱能神经元。并采用免疫细胞化学的方法,对爬片7天的细胞,通过胆碱乙酰转移酶(ChAT)进行胆碱能神经元的鉴定。将培养至第7天的胆碱能神经元进行随机分组：空白对照组、Apt-42组、Aβ142+抑制剂组和抑制剂组。分组后进行药物处理：空白对照组予以等量的培养液和PBS；Aβ1-42组：予以2μM的Aβ1-42；Ap1-42+抑制剂组：首先分别给予NF-kB抑制剂SN50(0.5μM)/p38MAPK抑制剂SB203580(2μM)/PKC抑制剂Chelerythrine chloride(CTC)(2μM),30min后,再分别加入Aβ1-42(2μM)继续培养；抑制剂组：分别予以SN50(0.5μM)/SB203580(2μM)/Chelerythrine chloride(CTC)(2μM)。药物处理后每组均培养至72h。收集并裂解细胞,然后提取蛋白,用BCA法检测蛋白浓度。取40μg总蛋白上样行蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,经电转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭,加入一抗(兔抗大鼠Kir6.2多克隆抗体或兔抗大鼠SUR1多克隆抗体)和二抗杂交,用发光试剂(ECL发光液)显色,以GAPDH作内参照,用图像分析软件进行光密度值分析。最后用SPSS统计分析NF-κB,p38MAPK和PKC三条通路各自对Aβ1-2诱导的KATP通道亚基Kir6.2/SUR1蛋白表达的影响。研究结果：(1)ChAT免疫细胞化学染色：胆碱能阳性神经元胞浆内呈棕黄色着色,阳性细胞计数结果显示90%以上；(2).Ap1-42作用72h后KATP通道亚基Kir6.2/SUR1蛋白表达均显著升高,具有统计学意义p<0.05或p<0.01)；(3).与Aβ142组相比较,SN50+Aβ1-42组的KATP通道亚基SUR1和Kir6.2蛋白表达显著降低p<0.01)；与空白对照组、Aβ1-42组相比,单独SN50组的KATP通道亚基SUR1和Kir6.2蛋白表达也均显著降低p<0.05或<0.01)；但与SN50+Aβ1-42组相比,单独SN50组的KATP通道亚基SUR1蛋白表达显著降低p<0.01),而亚基Kir6.2蛋白表达差异无统计学意义p>0.05)；(4).与Aβ1-42组相比,SB203580+Aβ1-42组的KATP通道亚基Kir6.2及SUR1蛋白表达均降低(p＜0.05或p<0.01);与空白对照、Aβ1-42组以及SB203580+Ap1-42组相比,SB203580组的KATP通道亚基Kir6.2蛋白表达是降低的p<0.05)；然而与SB203580+Aβ142组相比较,KATP通道亚基SURl蛋白表达没有差异(p>0.05)。(5)与Aβ1-42组相比,CTC+Aβ1-42组的KATP通道亚基Kir6.2及SUR1蛋白表达均明显降低(p<0.01)；与空白对照组、Aβ1-42组相比,单独CTC组的KATP通道亚基SUR1和Kir6.2蛋白表达也均显著降低p<0.05或p<0.01),但与CTC+Aβ1-42组相比,单独CTC组的KATP通道亚基SURl蛋白表达显著降低(p<0.05),而亚基Kir6.2蛋白表达差异无统计学意义((p>0.05)。研究结论：(1).原代培养的细胞90%以上为胆碱神经元；(2).Ap1-42作用72h后KATP通道亚基Kir6.2/SURl蛋白的表达升高可能原因是Aβ1-42诱发氧化应激导致线粒体功能失调,ATP下降,为维持细胞正常膜电位及电生理活动KATP通道被激活,从而起到防治Aβ1-42的细胞毒性作用；(3).NF-κB抑制剂SN50抑制Kir6.2/SUR1蛋白的表达,可能原因是SN50通过抑制NF-κkB核移位干扰NF-κB的生成,从而影响了NF-kB诱导增加Aβl-42水平,进一步影响了KATP通道亚基蛋白的表达。因此,NF-κB通路参与了Ap增加神经细胞KATP亚基表达的作用,阻断此通路能够减少神经细胞KATP亚基的表达。提示与神经元内Aβ1-42沉积有关的NF-kB活化是一种细胞保护反应；(4).p38MAPK抑制剂SB203580抑制Kir6.2/SURl蛋白的表达,SB203580与p38MAPK的特异性结合,使p38MAPK失去与ATP结合的能力,从而使其失去激酶活性,进一步影响了KATP通道亚基蛋白的表达,本实验也进一步证实了p38MAPK抑制剂能抑制或消除Ap诱导的培养的神经元的凋亡；(5)PKC抑制剂CTC抑制Kir6.2/SURl蛋白的表达,可能原因是剂CTC抑制PKC的活化,从而抑制PKC由胞浆向细胞膜转移,进而影响离子通道蛋白中的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化,使通道蛋白构象和门控动力学改变,最终调控离子通道的开闭,从而影响KATP通道。研究意义：信号通路NF-κB、p38MAPK、PKC均部分参与Aβ1-42诱导的KATP通道亚基Kir6.2/SUR1蛋白的表达,提示以上信号通路可能参与阿尔茨海默病的发生发展,为研究防治AD药物提供了新的理论依据。