紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)，是从红豆杉属植物中提取出来的一种具有高效抗肿瘤活性的天然物质。它是一种新型的微管稳定剂，具有独特抗癌活性。自1992年12月美国食品药品管理局(FDA)批准紫杉醇用于治疗晚期卵巢癌以来，其在临床上的应用范围逐渐扩展，并从二线药物变成一线用药，可以说是目前最好的抗癌药物之一。　　 紫杉醇是一种天然的三环二萜物质，有一个庞大繁杂的环状结构及众多的疏水性取代基，因而在水中的溶解性很差。临床应用的主要是紫杉醇注射液，即由乳浮EL(Cremophor EL，含聚氧乙烯蓖麻油)/无水乙醇(50：50)制成的无色黏稠状浓溶液。这种传统剂型设计的目的是为了改善紫杉醇的水溶性。但大量研究显示聚氧乙烯蓖麻油在体内可促使大量组织胺释放，产生过敏反应，而且还可溶解聚氯乙烯(PVC)输液器中的二乙烯己基邻苯二甲酸盐，带来严重的毒性反应，大大影响紫杉醇的临床安全应用。　　 基于上述原因，国内外众多科学家对紫杉醇的剂型改造进行了大量研究。本研究设计了一种两亲型嵌段共聚物，其亲水段为叶酸-聚乙二醇(Folate-PEG)，在人体内不会产生毒、副作用，无免疫源性，而疏水段为可生物降解的聚L-谷氨酸γ-苄酯(PBLG)，其降解产物为内源性物质谷氨酸，在体内不易产生蓄积和毒副作用，因此利用两组分形成的嵌段共聚物(Folate-PEG-PBLG)具亲水和疏水性为一体，在水溶液中可自组装形成球形核-壳结构的纳米胶束系统，其中疏水嵌段构成内核并作为微药库通过化学键合或物理包埋的方式结合紫杉醇，极大地增加紫杉醇的水溶性，释药具有突释阶段和缓释作用。同时亲水嵌段Folate-PEG作为胶束的外核，使纳米胶束躲避体内免疫系统的层层监视，降低被肝脾肺中网状内皮系统(RES)摄取，延长胶束在血液中循环时间。接枝叶酸的胶束，对肿瘤细胞的叶酸受体具有亲和力，提高肿瘤组织中药物紫杉醇的含量。　　 围绕上述研究目的，本文主要探讨了以下几方面的内容。　　 (1)聚乙二醇一聚谷氨酸苄酯(PEG-PBLG)嵌段共聚物的合成与表征　　 以单甲氧端基聚乙二醇(MePEG)和L-谷氨酸为原料，合成了一系列组成的PEG-PBLG嵌段共聚物，利用IR、1H-NMR对聚合物的结构进行了表征。结果表明，经阴离子聚合可以生成PEG-PBLG嵌段共聚物，其中PBLG嵌段的优势构象为α螺旋构象。　　 (2)叶酸-聚乙二醇一聚谷氨酸苄酯(Folate-PEG-PBLG)共聚物合成与表征　　 双端氨基的聚乙二醇(AT-PEG)在无水环境下偶联Folate，生成Folate-PEG-NH2,作为聚合反应的引发剂。通过引发剂Folate-PEG-NH2(I)引发活性单体BLG-NCA(A)的开环聚合，合成了一系列的Folate-PEG-PBLG嵌段共聚物，通过调节[A]/[I]的比例可控制聚合物的分子量。用IR、1H-NMR表征聚合物的结构。结果表明，Folate-PEG-NH2可引发高活性的BLG-NCA，经阴离子聚合反应生成Folate-PEG-PBLG共聚物，随着[A]/[I]的增加，共聚物分子量变大。　　 (3)Folate-PEG-PBLG纳米胶束的自组装　　 用膜透析法等不同方法制备Folate-PEG-PBLG两亲嵌段共聚物的纳米胶束，考察其粒径变化。用液相(HPLC)、紫外分光光度计(uv)验证Folate-PEG-PBLG胶束对难溶性的不同药物包埋，用HPLC、UV测定了胶束的载药量和包封率。结果表明，Folate-PEG-PBLG胶束能包埋疏水性药物，其载药量与载体的嵌段比有很大关系，疏水嵌段过大或过小都会引起胶束不稳定，载药量下降；载药量随投药量的增加而增加，但超过胶束包埋能力后，其包封率很快降低。　　 (4)Folate-PEG-PBLG纳米胶束性质的研究　　 用膜微透析法制备了Folate-PEG-PBLG纳米胶束，通过SEM观察该胶束粒子外部形态，用芘荧光探针法测定了临界胶束浓度(CMC)，通过动态光散射(DLS)测定了纳米胶束的粒径。结果表明，用膜微透析法制备纳米胶束呈球形或椭球形。Folate-PEG-PBLG胶束的粒径与载体聚合物的疏水嵌段，溶剂组成及载体聚合物浓度有关。疏水嵌段比例愈高，胶束粒径愈大；溶剂组成由纯DMF所得的胶束粒径最小且其载药胶束稳定；聚合物浓度愈大，透析所得胶束粒径愈大；载药胶束粒径受投药料比的影响不显著。　　 (5) Folate-PEG-PBLG胶束的体外释放试验　　 采用UV和HPLC测定不同药物的载药胶束在释药介质中药物的含量，观察Folate-PEG-PBLG载药胶束的体外释放特性，考察了释药介质在Folate-PEG-PBLG载药胶束中对释药的影响。结果发现，Folate-PEG-PBLG胶束释药过程具有突释阶段和缓释作用，释药介质的pH与被包埋药物的溶解性关系紧密，因而对其载药胶束的释药有很大影响。　　 (6)Taxol/Folate-PEG-PBLG冻干粉针剂的制备研究　　 Taxol/Folate-PEG-PBLG胶束采用冻干粉针剂，辅料甘露醇的含量5％，其溶液的最低共溶点是-18℃。冻结分了三个阶段，干燥分两个阶段，冻干后所得样品与透析所得新鲜载药胶束溶液的释药曲线基本相符。　　 (7)Folate-PEG-PBLG聚合物的细胞毒性试验　　 采用MTT法比较，在不同浓度下Folate-PEG-PBLG聚合物与紫杉醇注射剂中增溶剂聚氧乙烯化蓖麻油的体外Hela细胞毒性。结果表明：Folate-PEG-PBLG聚合物对Hela细胞增殖抑制作用很低，接枝叶酸后所得的Folate-PEG-PBLG没有增加PEG-PBLG聚合物对Hela细胞的毒性。与临床所用紫杉醇注射剂中增溶剂的细胞毒性相比，Folate-PEG-PBLG聚合物的细胞毒性降低。　　 (8)Taxol/Folate-PEG-PBLG胶束体外药效试验　　 在不同Taxol药物浓度下，采用MTT法比较了Taxol/Folate-PEG-PBLG胶束与临床使用的紫杉醇注射剂对癌细胞疗效。结果表明，当含紫杉醇浓度高于20μg/ml时，因溶液为饱和紫杉醇浓度，对癌细胞的抑制杀灭效果是一样的。各个实验组细胞毒性评分均为4，表现明显的细胞毒性：低于20μg/ml，Taxol/Folate-PEG-PBLG胶束包裹的药物仅部分释放，杀灭癌细胞疗效要远低于具有增溶剂毒性的紫杉醇注射剂(P<0.01)。　　 (9)Folate-PEG-PBLG胶束对叶酸受体选择性研究　　 在无叶酸培养基中，Folate-PEG-PBLG载药胶束与无叶酸基团的PEG-PBLG载药胶束相比，能显著的降低对具有高水平叶酸受体表达的H0-8910、HepG-2的细胞相对增殖百分率(RGR)(P<0.01)；而对无高水甲叶酸受体表达A549的RGR，两者没有显著性差异(P>0.05)。在利用荧光显微镜和流式细胞仪研究后表明：培养基中无游离叶酸，接枝叶酸的胶束，具有高水甲叶酸受体表达的肿瘤细胞，这三者同时存在情况下，胶束才特异性表达与肿瘤细胞中叶酸受体的结合。以上说明：Folate-PEG-PBLG胶束对具有高水平叶酸受体表达的HO-8910、HepG-2肿瘤细胞具有靶向性。　　 (10)Taxol/Folate-PEG-PBLG胶束的药效学实验　　 采用肿瘤瘤块皮下移植法建立了人肝癌HepG-2细胞裸鼠移植模型，对比观察了Taxol/Folate-PEG-PBLG胶束与紫杉醇注射剂对裸鼠肝癌模型的疗效。结果表明，裸鼠皮下移植瘤块可成功建立了人肝癌裸鼠移植模型。Taxol/Folate-PEG-PBLG胶束对裸鼠的肿瘤生长具有明显抑制作用。Taxol/Folate-PEG-PBLG组治疗肿瘤疗效高于紫杉醇注射剂组(P<0.01)，而制剂毒性明显低于紫杉醇注射剂组。　　 (11)Taxol/Folate-PEG-PBLG胶束在大鼠体内的药代动力学研究　　 Taxol/Folate-PEG-PBLG胶束组的AUCo-t、MRT、CL等与紫杉醇注射剂对照组比较，均有统计学意义(P<0.05)，载药胶束组的半衰期t1/2可升高至2.44倍，延长了载药胶束微粒在体循环中时间。实验表明紫杉醇载药胶束该制剂提高了药物生物利用度，提高了半衰期t1/2,相比临床所用紫杉醇注射剂有一定进步。　　 (12)Taxol/Folate-PEG-PBLG胶束在荷瘤裸鼠中的体内分布　　 Taxol/Folate-PEG-PBLG胶束改变了药物紫杉醇的溶解性，进而改变其在肺蓄积分布。载药胶束表面亲水性的PEG长链，可以躲避RES识别与摄取，延长胶束体循环时间，从而降低了紫杉醇在肝脏等脏器的浓度。接枝叶酸的胶束能特异性结合肿瘤细胞中叶酸受体，提高药物在肿瘤组织中浓度，表明接枝叶酸胶束具有肿瘤靶向性。　　 综上所述，以Folate-PEG-PBLG嵌段共聚物为载体，制备了紫杉醇自组装核壳型纳米胶束系统，该胶束系统具有良好的粒径分布和缓释作用，低材料毒性和在动物实验中表现良好的抗肿瘤作用，降低了紫杉醇在肝脏等脏器的浓度，提高在肿瘤组织中浓度。使紫杉醇纳米胶束剂型达到高效、低毒的目的，为紫杉醇的抗肿瘤治疗提供了理论依据和实验基础。