流行性感冒(inf luenza,简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,是对人类健康威胁最大的传染病之一,具有传染性强、发病率高、流行面广及死亡率高特点,是人类至今尚不能有效控制的世界性传染病。据统计,流感每年的发病率为10%-30%,估计全球每年约有50万人死于流感。我国是流感的多发国,且流感的死亡率均较高。据调查20世纪50年代末我国流感的病死率高达0.6%～1.4%；1997年开始出现的H5N1禽流感近年来皆有散发,致死率高达66%-80%；2009年新型甲型H1N1(Pandemic A/H1N1/2009/influenza,pHlNl)发病急,传播面广,造成全球214个国家和地区发病,18,449人死亡,死亡率近1.5%；2013年3月在上海和安徽两地初夏全球首次发现的新亚型流感病毒H7N9禽流感,感染者发病迅速,病情较重,早期死亡率高达35%。三种高致死流感主要死因均为呼吸系统的并发症,特别是重症肺炎和呼吸窘迫综合征(ARDS)。因此,重症流感的治疗仍然是临床的重点和难点,亟需有效的药物治疗。流感属中医“外感热病”范畴,事实证明,中医药通过辩证论治治疗甲型H1N1流感取得国内外同行的认同。甲型HlN1流感以发热为主要特征,具有温热病性质,在发病过程中有热邪燔灼、耗气伤津和热迫血溢的病理表现；病性初起实证居多,病机以热毒、瘀毒、气阴不足为关键。瘀是疫毒蕴结,热邪煎熬,形成血瘀和瘀血；虚为正气虚,在流感的潜伏期和发病之初即有正气虚,重症患者虚证日渐突出,始则肺主气司呼吸障碍,继则肾不纳气,或毒热内陷心包致神志谵妄、昏迷甚则死亡。临床表明,早期配合应用益气养阴凉血之品可提高治疗效果,减少肺部病灶渗出、出血等,及时应用活血散结药物对阻止病灶扩散,加快病灶吸收有重要作用。又由于疫毒之邪容易耗气伤阴,故顾护气阴是维持正气的重要方面,存的一份气阴则有一分生机。但临床对于何时祛邪解毒与何时扶助正气存有争议,有认为瘟疫早期、中期当以祛邪解毒为要,不宜补,亦有认为重症或危重症则应首先扶助正气,其次才考虑祛邪解毒。针对这一争议,本实验进行了动物实验研究,初步回应了临床上的一些问题和不同观点。实验目的：通过建立适宜中药注射液干预治疗的流感重症肺炎小鼠模型,开展以清热解毒为主的热毒宁注射液(热)、以凉血化瘀为主的血必净注射液(血)、以益气养阴为主的参麦注射液(参)等三类不同治法注射液两两联合应用干预重症流感病毒性肺炎的动物实验,探索中医药不同治法注射剂联合应用干预重症流感病毒性肺炎的最优组合方案、用药时机及初步作用机制。实验方法：实验一通过比较C57BL/6小鼠与Balb/C小鼠感染A/Bei jing/501/2009(H1N1)(BJ501)株后的死亡率、湿干比比较两种品系小鼠对BJ501病毒株的易感性,最终确立流感重症肺炎模型的品系、病毒量,并通过肺组织病理评价模型是否成功。实验二分组及给药：将小鼠随机分为正常组；模型组；潜伏期给药组,包括热+血组、热+参组、血+参组；参麦早期给药组,包括热+参(48h)组、血+参(48h)组等七组,每组小鼠25只。其中,热+血组、热+参组、血+参组三组各药均于感染后即刻给药,热+参(48h)组、血+参(48h)组两组,热毒宁与血必净分别于感染后即刻给药,参麦均于感染后48h给药。热毒宁注射量为稀释后0.1ml/只,血必净注射量为原液0.15ml/只、参麦注射量为原液0.1ml/只,均连续给药5天,观察期为14天。观察指标：各组小鼠的死亡保护率、体重变化(n=10),肺湿干比(n=5),肺组织病理(n=5)、肺灌洗液细胞因子IL-6.IL-10.MCP-1.IFN-γ.TNF-α的水平(n--5)。实验结果：实验一C57BL/6小鼠感染不同稀释度的BJ501病毒后,其死亡率、肺湿干比都高于Balb／C小鼠,有统计学差异。C57BL/6小鼠感染后第5天,肺脏出现弥漫性炎症细胞浸润,肺泡上皮细胞脱落、坏死,支气管上皮细胞变性,伴有水肿、淤血、出血等重症肺炎征象。实验二1.死亡保护率、体重变化及一般状况1)死亡保护率：14天观察期结束后,正常组小鼠全部存活,存活率为100%；模型组存活3只小鼠,存活率为30%；血必净+热毒宁组存活5只小鼠,存活率为50%,与模型组有统计学差异(P<0.05)；热+参组、血+参组均存活4只小鼠,存活率为40%,与模型组有统计学差异(P<0.05)；热+参(48h)组小鼠全部死亡,存活率为0,与模型组有统计学差异(P<0.05)；血+参(48h)组存活3只小鼠,存活率为30%,与模型组无统计学差异(P>0.05)。2)体重变化：小鼠体重均从第2天开始下降。其中,热+血组体重下降最慢,热+参组、血+参组体重优于模型组,仅次于热+血组。热+参(48h)组小鼠体重下降最速,血+参(48h)组与模型组相同。3)一般状况：热+血组小鼠与正常组相似,精神状况良好,呼吸平稳,饮食如常,皮毛光亮润泽,以手握之小鼠体暖。其余各组小鼠一般状况与模型组相似,精神不振,聚集成团,呼吸急促,身体抖动,毛发耸立,弓背蜷缩若恶寒颤栗状,以手握之小鼠冰凉。2.肺湿干比的测定热+血组的湿干比低于模型组,有统计学差异(P<0.05)；热+参组、血+参组的湿干比均低于模型组,但无统计学差异(P>0.05)；热+参(48h)组的湿干比高于模型组,无统计学差异(P>0.05)；血+参(48h)组与模型组湿干比接近,无统计学差异(P>0.05)。3.肺脏病理检测模型组,炎症活动度(+++),镜下可见弥漫性炎症细胞浸润,肺泡上皮细胞脱落、坏死,支气管上皮细胞变性,伴有水肿、淤血、出血。热+血组,炎症活动度(++),肺血管支气管周围炎性细胞浸润,支气管上皮细胞脱落、坏死,肺泡间隔增厚,炎性细胞浸润,伴有水肿及纤维素性渗出。热+参组,炎症活动度(+++至+++),肺弥漫性炎性细胞浸润,支气管上皮细胞变性、坏死,肺泡上皮脱落,伴有纤维素性渗出。血+参组,炎症活动度(++),肺支气管上皮细胞变性、坏死,肺泡间隔炎性细胞浸润,伴有轻微纤维素性渗出。热+参(48h)组,炎症活动度(++++),肺脓肿,实变,大量炎性细胞浸润,支气管上皮增生。血+参(48h)组,炎症活动度(++++),肺脓肿,实变,大量炎性细胞浸润,支气管上皮细胞脱落、坏死,肺泡扩张。4.肺泡灌洗液细胞因子检测BJ501流感株感染小鼠48h后,IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF-α等炎性因子、抗炎因子均升高,其中,IL-6, IL-10, IFN-γ三个细胞因子在感染后48h、96h持续升高,MCP-1在感染后96h大幅下降,TNF-α水平此时则恢复正常。感染48h时,各给药组均可不同程度降低IL-6. IL-10. IFN-γ的水平。感染96h时,热+血、热+参、血+参3组IL-6的水平恢复正常,而热+参(48h)、血+参(48h)IL-6的水平均低于正常组；各治疗组可降低IL-10的水平,热+参(48h)组IL-10的水平最低；各治疗组IFN-γ的水平均低于模型组,热+参(48h)组IFN-γ的水平最低。结论：C57BL／6小鼠较Balb/C小鼠对BJ501流感株易感。BJ501流感株感染4-6周龄C57BL/6小鼠所致重症肺炎小鼠模型成功。以清热解毒为主的热毒宁注射液、以凉血化瘀为主的血必净注射液、以益气养阴为主的参麦注射液,三者两两配伍应用即刻(潜伏期)干预重症流感小鼠疗效明确,其中以热毒宁注射液与血必净注射液配伍疗效最优,提示中药注射液尽早干预对流感重症肺炎的预后有重要作用。以益气养阴为主的参麦注射液在小鼠感染后48h(早期)给药,对重症肺炎小鼠无疗效,甚至使小鼠全部死亡,可能与此时适应性免疫应答启动,而加入参麦后抑制了免疫反应有关,提示温热病发病早期应用益气养阴药应慎重。