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目的本研究在成功建立肝脏缺血再灌注模型的基础上,探索岩白菜素通过清除ROS,影响PPAR-γ从而抑制细胞自噬和凋亡的药理机制,为临床用药提供更新的理论依据。方法1.将24只Balb/C雄性小鼠随机分为生理盐水对照组(Control组)、假手术组(Sham组)、假手术盐水对照组(Sham+Saline组)及单纯药物组(Sham+Bergenin组),其中假手术组给予开关腹处理。在手术前3 d,给予生理盐水或药物(40mg/kg)处理,采集所有小鼠的血清及肝组织,通过生化分析、HE染色、ELISA法及Western Blot等方法观察不同组别之间肝脏转氨酶水平、病理改变及炎症和凋亡自噬相关标志分子的差异性改变。2.将120只Balb/C雄性小鼠分别称重后,随机分为假手术组(Sham组)、模型组(IR组)、药物处理组(IR+B ergenin组)。在建立模型前3d,通过灌胃的方式给予不同浓度的药物处理(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg),采集关腹后2h、8h和24 h(每组24只,每时间点8只)的小鼠血清及肝组织,分离血清检测血清中ALT、AST的含量,评价病理损伤水平。选取损伤最严重的8h时间点提取总蛋白及RNA等,通过ROS染色、ELISA、qRT-PCR、免疫组织化学染色及Western Blot等方法检测相关炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)、通路相关分子(PPAR-γ、RXR-α、NF-κB、P38 MAPK)以及凋亡自噬相关蛋白(Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-9、Beclin-1、LC-3、P62)在基因和蛋白水平的表达,从而探索岩白菜素的作用机制。3.培养正常的肝细胞(LO2),通过使用岩白菜素(3 mM)及GW9662(10μM)处理将细胞分为正常组(Normal组)、模型组(IR组)、药物组(IR+B ergenin组)、抑制剂组(IR+Bergenin+GW9662)组,所有的细胞经药物处理后行缺氧及复氧处理,通过CCK-8、qRT-PCR及Western Blot等方法检测细胞的生存比例及通路相关分子(PPAR-γ、RXR-α)的表达水平,以进一步验证岩白菜素的作用机制。结果1.单纯药物与不同对照组间ALT和AST水平差异无明显统计学意义(P>0.05);各组间肝脏组织的HE染色均未出现明显病理性坏死改变;血清炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)及作用相关蛋白(Bcl-2、Bax、Beclin-1及PPAR-丫)水平在各组间均未出现明显差异(P>0.05)。2.模型组的ALT和AST水平较对照组明显升高(P<0.05),而使用不同浓度的岩白菜素进行预处理后,肝酶水平在2h、8h及24h均出现一定程度的下降,以8h最为明显;与以上结果相一致,HE染色显示模型组出现片状水肿及坏死表现,而药物处理组(40mg/kg)坏死区域显著减少,组间差异明显(P<0.05)。3.选取损伤最严重的8 h进行后续研究,ROS染色显示模型组代表标志分子的荧光呈亮红色,而使用岩白菜素进行处理后,荧光亮度下降且具有浓度依赖性,组间差异具有统计学意义(P<0.05);通过ELISA及PCR技术对炎症因子进行检测,发现TNF-α、IL-6及IL-1β在IR组出现明显升高,而随着药物浓度上升依次下降,差异具有统计学意义(P<0.05);通过免疫组织化学技术对TNF-α、IL-6进行了进一步验证,结果与上述一致。4.通过 PCR 技术及 Western Blot 等对组织中的 Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-9、Beclin-1、LC-3及P62等基因进行检测。模型组的促凋亡蛋白Bax及Cleaved Caspase-9水平明显低于对照组,而进行药物处理后出现下降,与其相反,抑制凋亡蛋白Bcl-2在模型组下降而在药物处理组上升,差异具有统计学意义(P<0.05);同样,与自噬呈正相关的Beclin-1和LC-3与Bax一致,而负相关的P62与Bcl-2一致;Tunel染色和电镜进一步直观的证明模型组与对照组相比,凋亡细胞和自噬小体比例明显上升,而在药物处理组随着浓度上升而依次下降,差异均具有统计学意义(P<0.05)。5.通过PCR技术及Western Blot技术等对组织中的PPAR-γ、RXR-α、NF-κB、P38 MAPK进行基因和蛋白水平的检测。结果发现,模型组的PPAR-γ、RXR-α明显低于对照组,而岩白菜素提高了其表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05);与此同时,NF-κB、P38 MAPK等通路蛋白的磷酸化水平则在模型组显著上调,而在药物处理组出现了明显下降,通过免疫组织化学技术对PPAR-γ、p-P38的检测进一步验证了以上发现,以上结果差异均具有统计学意义(P<0.05)。6.分别用岩白菜素(3 mM)及PPAR-γ的抑制剂GW9662(10μM)处理正常肝细胞,待缺氧及复氧处理后,CCK-8显示模型组细胞存活率明显降低,而药物处理组升高,加入GW9662后细胞存活率出现明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);同时,我们进一步通过PCR及Western Blot技术对相关蛋白进行检测,发现模型组细胞中PPAR-γ水平下降,在药物处理明显减弱损伤效应的同时,GW9662加重了细胞死亡,以上结果组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论1.岩白菜素可有效降低肝酶水平,改善肝脏缺血再灌注损伤诱导的肝脏病理变化。2.岩白菜素可通过清除ROS,调节P38 MAPK/PPAR-γ途径降低炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)等释放,并有效抑制肝细胞凋亡和自噬引起的肝损伤。