帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是人类最常见的第二大神经系统退行性疾病,多发于中老年人群。其主要临床症状为静止性震颤、肌僵直、行动迟缓和姿势异常等。PD的主要病理特征是路易小体的出现和黑质致密部多巴胺能神经元的退行性病变和死亡。PD的具体发病机制尚未明确。病因学研究显示,PD的发病是年龄老化、环境毒素、遗传等因素综合作用的结果,其中环境毒素在PD的后天发展中占据主导地位。自从神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）被发现能够诱导机体出现帕金森病类似的症状以来,其结构类似物儿茶酚异喹啉类化合物（CTIQs）与PD的相关性引起了学者的广泛关注。CTIQs属于内源性神经毒素,由脑内氧化应激导致的脂质过氧化反应生成的活性醛与多巴胺经生物酶催化生成;CTIQs经过氮甲基化和氧化后生成的产物能够与线粒体复合物I结合,造成能量代谢障碍的同时也加剧了细胞内的氧化应激水平,形成恶性循环,最终导致多巴胺能神经元的变性死亡。在此恶性循环过程中,催化CTIQs生成的生物酶是目前研究的重点和难点,由于含量少、纯化困难等因素,使得内源性神经毒素导致PD发病的机制研究停滞不前。Salsolinol合成酶（Sal合成酶）是CTIQs合成和代谢过程中的首个关键酶,它能够催化多巴胺（DA）和乙醛生成Sal,并加剧后续相关产物的生成和代谢,与PD的致病机制关系密切。迄今为止,国际上关于该酶的研究报道较少,本课题组长期致力于该酶的研究工作,前期已经从鼠脑中对其进行分离、纯化和鉴定,并进行了初步的酶学性质研究,然而该酶的确切生物学功能仍然未知。Sal合成酶生物学功能的实现依赖其催化产物Sal,近年来关于Sal的神经毒性存在争议,其导致多巴胺能神经细胞死亡的机制尚未完全阐明,因此本课题主要围绕Sal合成酶及其产物展开相关研究,具体包括以下几方面:1、采用6-羟基多巴胺（6-OHDA）构建PD细胞模型和动物模型,探究PD模型中Sal合成酶的活性、分布及产物等的生成情况。结果显示Sal合成酶在细胞和大鼠纹状体、中脑、海马、皮层中均有活性分布,且在细胞模型组和动物模型组纹状体中酶的活性升高。成功检测了大鼠脑区中Sal的含量,且模型组中脑区Sal的含量升高。2、构建Sal合成酶过表达的细胞模型和Sal合成酶转基因小鼠,从细胞水平和活体水平揭示Sal合成酶对多巴胺能神经细胞的影响。细胞水平的研究显示,Sal合成酶是一种胞浆蛋白,主要分布于细胞质中。Sal合成酶在细胞内过表达48 h后活性增强,CTIQs类神经毒素Sal和NM-Sal的含量显著上升。流式细胞仪检测发现Sal合成酶过表达后线粒体膜电位下降,提示细胞进入凋亡早期阶段,细胞凋亡情况的检测结果与之相符。对相关细胞凋亡因子的研究显示,Sal合成酶能够抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达并促进促凋亡蛋白Bax的表达,并且这一结果在Sal体外诱导实验中得到验证。在活体水平方面,繁育了Sal合成酶的FVB转基因小鼠,从行为学和病理学检测Sal合成酶的过表达与PD的关系。结果显示,13月龄的Sal合成酶转基因小鼠在爬杆实验中出现运动迟缓的症状,然而黑质致密部的免疫组化染色中没有发现显著差异,由此推测,Sal合成酶在活体中导致的神经毒性需要时间的累积,该酶单独作用不足以直接导致动物机体中PD症状的发生,符合PD发病因素复杂的特点。3、在Sal合成酶导致细胞凋亡发生的进程中,其催化产物Sal发挥了关键作用。为了阐明Sal导致多巴胺能神经细胞死亡的分子机制,本研究利用全转录组测序技术（RNA-seq）筛选出了Sal诱导后发生显著变化的相关基因和信号通路。测序结果发现,与RNA甲基化（FTO/Mettl3/Mettl23）、凋亡（Bad）和转录因子（Foxa3）等相关基因在内的740个基因表达上调,与自噬（Atp264/Atg1611）、DNA甲基化（Dnmt3a/Dnmt1）和转录因子（FoxO1）等相关基因在内的1665个基因表达下调。GO分析结果显示差异表达基因主要定位在线粒体内膜、溶酶体腔、高尔基体等细胞组分中,改变离子结合能力和酶的催化活性等功能。miRNA的调控、自噬和细胞极性的调节等生物过程受到影响。KEGG富集结果显示Sal影响Akt、TOR和FoxO等信号通路,为后续的Sal毒性机制研究提供了依据和靶点。4、基于RNA-seq分析结果,从Akt-mTOR信号通路和自噬的角度揭示Sal诱导多巴胺能神经细胞发生凋亡的分子机制。Sal诱导降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,细胞发生凋亡。通路研究显示,Sal诱导使Akt和mTOR磷酸化水平升高,LC3Ⅱ/Ⅰ下降,说明Sal通过激活Akt-mTOR信号通路抑制细胞内的自噬水平。Sal诱导也降低了细胞内Ca²⁺浓度、钙通道相关蛋白NMDAR1和多巴胺受体基因Drd3的表达水平,表明Sal诱导后细胞膜上和内部信号传导能力变弱。细胞内去甲基化酶FTO的表达水平在Sal诱导后也降低,导致RNA甲基化修饰6-甲基腺嘌呤（m6A）的水平升高。除此之外,Sal还能够部分逆转6-OHDA引起的FTO和NMDAR1表达的升高,是一种潜在的去甲基化酶和NMDAR1受体拮抗剂,具备一定的临床应用价值。通过上述研究,本课题明确了Sal合成酶及其产物在多巴胺能神经细胞凋亡过程中发挥了重要毒性作用。Sal合成酶通过催化Sal的生成损害线粒体,促进凋亡,最终导致多巴胺能神经细胞死亡。体外诱导试验表明Sal通过激活Akt-mTOR信号通路抑制细胞内自噬流,最终引起细胞的死亡。在该过程中,NMDAR1-Ca²⁺信号传导途径和RNA甲基化修饰发挥了调节。综上所述,Sal合成酶和Sal是导致多巴胺能神经细胞死亡的关键因子。