研究背景丹皮酚(paeonol,Pae)是毛茛科植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)根皮和萝藦科植物徐长卿Pycnostelma Paniculatum(Bunge)K.Schu全草的主要活性成分,具有镇静、催眠、解热、镇痛、抗炎、抗过敏和抗菌等多种药理活性。临床上用于治疗风湿痛、胃痛和其他疼痛、湿疹、过敏性皮炎等,均具有较好疗效。丹皮酚经皮给药用于湿疹、过敏性皮炎等疾病治疗,克服了传统激素类药物停药后易复发、副作用大等缺点;近几年研究发现丹皮酚能抑制黑色素细胞内酪氨酸酶活性及黑色素生成,对色斑、皮肤瘙痒、牛皮癣等具有较好的治疗作用。但由于其水溶性差、熔点低、易挥发和稳定性差等缺点,限制了它的使用和疗效。丹皮酚皮肤给药现有剂型主要是软膏剂,随着制剂技术的发展,为了克服丹皮酚本身水溶性差、易挥发、稳定性不好等缺点,近年来出现了β-环糊精包合技术,w/o/w型复乳型凝胶,磷脂复合物,脂质体等新技术,但均存在着稳定性差,载药量小,得率低等缺点,不易用于工业化大生产。前非离子体(proniosomes)是一种继脂质体、非离子表面活性剂囊泡(niosome)后的一种新型的药物储库型剂型,它是以非离子表面活性剂为辅料制成的囊体,使用前水合即可产生非离子表面活性剂囊泡的水合分散体。1999年胡成就等首次描述了前非离子体为一种干燥的、具有流动性的颗粒状粉末,遇水即可形成多室的非离子表面活性剂囊泡。因此可以有效改善非离子表面活性剂囊泡在储存过程中囊泡易聚集、融合及药物泄露等问题,并在运输、储存、使用方面具有明显优势。前非离子体凝胶是基于非离子表面活性剂存在不同的液晶相囊性系统,将乙醇中的表面活性剂与水相限量水合混合形成前非离子体凝胶。由于水限量,该系统呈现粘稠性质,可直接用于皮肤上进行自身水合形成非离子表面活性剂囊泡,将其运用到经皮给药系统中,具有以下优势:①原料易得、价格较便宜、稳定性好、易于工业化生产;②非离子表面活性剂分子两端具有亲水性及亲脂性,能够包封两亲性药物且无毒;③将药物包封于非离子表面活性剂囊泡中,延缓了药物释放,能提高药物生物利用度;④有效改善脂质体、非离子表面活性剂囊泡在储存过程中囊泡易聚集、融合及药物泄露等问题,并在运输、储存、使用方面具有明显优势。目前前非离子体已经用于多种药物的经皮给药系统研究,如长春西汀、氟比洛芬、吡罗昔康、酮咯酸、左炔诺酮等,表明前非离子体已经作为新型的药物载体活跃于药剂学领域中。目的本课题将丹皮酚制备成前非离子体,开发新型经皮给药体统。确定丹皮酚前非离子体处方组成及制备工艺,并对其水化后形成的非离子体表面活性剂囊泡进行性状分析;通过改良Franz扩散池实验比较丹皮酚前非离子体软膏与普通软膏体外透皮性能;利用微透析采样技术与HPLC分析法联用,进行药代动力学研究;通过皮肤刺激性实验评价其对家兔的皮肤刺激性。方法一、丹皮酚理化性质和含量测定方法学研究采用HPLC法建立丹皮酚的体外含量测定方法,并对其方法的精密度、稳定性、重现性、专属性及加样回收进行研究,为前非离子体的处方筛选及体外透皮渗透实验、药代动力学实验奠定方法学基础;采用饱和溶液法对丹皮酚的平衡溶解度进行测定。二、丹皮酚前非离子体的制备研究采用单因素筛选法考察不同的包封材料(不同的非离子表面活性剂:司盘-40、60、80,吐温-20、60、80)对制剂成型的影响,以药物包封率和水化后能否形成非离子表面活性剂囊泡为筛选指标,优选最佳包封材料;同时考察不同的药物含量对药物包封率的影响,确定药物含量;再采用星点设计-效应面法,以粒径大小和药物包封率作为参考指标,以不同表面活性剂量、胆固醇量及大豆卵磷脂量为因素指标,考察其对制剂成型的影响,优选最佳配方。采用透射电子显微镜,对水化后形成的非离子表面活性囊泡形态进行观察;采用马尔文激光散射粒径测定仪测定囊泡粒径大小及分布。三、丹皮酚前非离子体软膏的制备及体外透皮渗透实验研究将丹皮酚前非离子体制备成软膏,同时制备相同含量的丹皮酚普通软膏;以离体裸鼠皮肤为透过膜,采用改良的Franz扩散池,以生理盐水为接收液,每隔一定时间吸取接收液,采用HPLC法测定丹皮酚含量,比较丹皮酚前非离子体、丹皮酚前非离子体软膏及丹皮酚普通软膏单位面积累积经皮渗透量Q及稳态渗透速率Js。四、丹皮酚前非离子体软膏经皮给药系统的皮肤药代动力学研究以大鼠为动物模型,采用皮肤、血液同步微透析法与HPLC法相结合,实时监测大鼠皮下组织液及血液中丹皮酚浓度,获得大鼠皮下组织液、血液中药物浓度随时间变化的药时曲线,采用PKSolver药动学软件进行统计比较。五、丹皮酚前非离子体软膏对家兔皮肤刺激性实验研究采用家兔皮肤刺激性试验(FHSA),评价丹皮酚前非离子体软膏对家兔完整皮肤和破损皮肤的外用刺激性,为今后用于临床提供依据。结果一、丹皮酚理化性质和含量测定方法学研究为准确测定丹皮酚的含量,本课题首先建立了稳定可靠的丹皮酚检测方法。采用HPLC法进行研究,色谱条件为:色谱柱为SyncronisC18(5μm,4.6mmX 250mm);流动相为甲醇:水(60:40);流速为1.0ml·min-1;柱温25℃;检测波长为276nm。并进行了相关的方法学研究,均符合要求。同时测定了丹皮酚的平衡溶解度,丹皮酚在蒸馏水、生理盐水、pH5.0PBS溶液、pH7.4PBS溶液中的平衡溶解度分别为714、682、661.4、608.9μg·ml-1,均能达到漏槽条件,最终选定生理盐水为经皮渗透实验的接收液。二、丹皮酚前非离子体的制备研究采用单因素筛选法,筛选出以司盘-60为包封材料。再采用星点设计-效应面法(RSM-CCD)优化前非离子体处方。优选出的丹皮酚前非离子体处方为:胆固醇量为7.53mg,大豆卵磷脂的量为107.86mg,司盘-60为74.49mg,丹皮酚量为5mg。按照优化的处方制备6批前非离子体,其平均包封率为64.16%,平均粒径为11.15 μm,与模型预测值相差不大。经TEM观察显示,为类球形实体粒子,粒径大小均匀,具有良好的重现性。三、丹皮酚前非离子体软膏的制备及体外透皮渗透实验研究将丹皮酚前非离子体与软膏基质按1:1比例混合,得到丹皮酚前非离子体软膏,同时制备同含量的丹皮酚普通软膏。体外透皮渗透实验结果显示,丹皮酚前非离子体及其软膏、普通软膏的稳态渗透速率分别为(10.327μ g·cm-2·h-1、7.826μ g · cm-2 · h-1、5.967μg · cm-2 · h-1),单位面积累积经皮渗透量Q分别为(125.54 ± 8.87μg·cm-2、96.20±5.87μg·cm-2、75.83±18.42 μg·cm-2),表明丹皮酚前非离子体及其软膏经皮渗透能力均高于丹皮酚普通软膏。四、丹皮酚前非离子体软膏经皮给药系统的皮肤药代动力学研究在进行微透析实验前,分别测定了探针体外回收率和体内回收率,体外回收率为54.80±1.50%,体内回收率为54.58±4.61%。结果显示两种方法测得的回收率在不同浓度下基本保持一致,可以采用体内回收率来校正在体微透析试验的数据。丹皮酚普通软膏血液中的药动学参数分别为Cmax(2589.9±372.9ng·ml-1)、Tmax(46.67±23.1min)、AUC0-720min(910149.8± 147788.1ng ·min ·ml-1)、AUC0-∞(1165728 ± 189090.4 ng· min ·ml-1)、t1/2(179.50±70.9min)、MRT(189.77±49.8min),而丹皮酚前非离子体软膏的药动学参数分别为Cmax(1513.24±215.7ng · ml-1)、Tmax(146.67 ± 46.2min)、AUC0-720min(611709.3 ± 94203.0 ng ·min ·ml-1)、AUC0-∞(723143.2±181992.2ng ·min ·ml-1)、t1/2(349.67±40.9min)、MRT(368.94±76.1min)。由上述结果可知丹皮酚前非离子体软膏的t1/2、MRT、Tmax明显大于普通软膏,而AUC值、Cmax相反,表明丹皮酚前非离子体软膏经大鼠腹部皮肤给药后丹皮酚较少的进入血液中,但其在体内的消除较慢,平均滞留时间也较长,药物浓度波动不大。而普通软膏中的药物更多的集中在血液中,但体内消除较快,平均滞留时间较短。丹皮酚前非离子体软膏皮下药动学参数分别为Cmax(2806.72±241.7 ng·ml-1)、Tmax(460±lOOmin)、AUC0-720min(1285802±184964.9ng·min·ml-1)、AUCo-∞(1932291 ± 742558.5ng ·min ·ml-1)、t1/2(571.58 ± 118.3min)、MRT(545.67±89.68min),而丹皮酚普通软膏药动学参数分别为Cmax(2162.72±146.8ng·ml-1)、Tmax(40±20min)、AUC0-720min(927479.9±61942.0ng ·min ·ml-1)、AUC0-∞(1147715 ± 347541.3ng· min ·ml-1)、t1/2(74.55±4.7min)、MRT(361.38±95.6min),由上述结果可知丹皮酚前非离子体软膏各项药动学参数均大于普通软膏。表明丹皮酚前非离子体软膏经皮给药后,丹皮酚更多的聚集在皮下组织液中,药物的达峰浓度高,平均滞留时间长,体内消除慢,可维持10h,起到了一定的缓释、长效作用。而丹皮酚普通软膏经皮给药后,较短时间达到峰值,但体内消除快,持续时间短,仅能维持6h。通过比较皮下组织液与血液中的药动学参数大小,丹皮酚前非离子体软膏经皮给药后中药物更多的集中在皮肤组织液中而不是广泛分布在全身血液,而丹皮酚普通软膏相反。五、丹皮酚前非离子体软膏对家兔皮肤刺激性实验研究家兔皮肤刺激性实验结果均显示丹皮酚前非离子体软膏对家兔的正常及破损皮肤均无明显的可见刺激。结论一、丹皮酚前非离子体的制备工艺研究中,采用单因素筛选法确定了前非离子体的包封材料(Span60)及药物含量(5mg);星点设计-效应面法优选出了前非离子体的最优处方,即:丹皮酚量为5mg、胆固醇量为7.53mg,大豆卵磷脂量为107.86mg,司盘60为74.49mg。二、体外经皮渗透实验结果表明前非离子体及前非离子体软膏经皮渗透作用明显优于丹皮酚普通软膏。三、药代动力学研究表明丹皮酚前非离子体软膏经皮给药后药物更多的聚集在皮肤组织液中而较少的分布在全身血液中,与普通软膏相比,无论是皮下组织液还是血液中,其平均滞留时间均较长,体内消除慢,起到了一定的缓释、长效作用;而丹皮酚普通软膏经皮给药后,药物更多的集中在血液中,且无论是皮下组织液还是血液中丹皮酚的消除均较快,平均滞留时间较短。四、皮肤刺激性实验结果表明无论是单次给药组还是多次给药组,丹皮酚前非离子体软膏对家兔背部皮肤均无刺激性。