论文部分内容阅读
目的: MicroRNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的内源性、非编码小分子RNA,通过与其靶基因的3UTR区互补配对抑制靶基因的翻译过程,或者直接降解靶基因的mRNA。miRNA在细胞增殖、分化、个体发育以及多种病理过程中起着重要的调控作用。近视是全球发病率最高的一种屈光不正,表现为眼轴的过度延长,但是其发病机制尚未明确。研究发现眼轴的延长与巩膜生物力学性能密切相关,在很大程度上依赖于巩膜细胞外基质的组成。目前公认巩膜重塑在近视发生发展过程中具有重要意义。在近视的发生过程中,巩膜的细胞外基质减少,Ⅰ型胶原是巩膜细胞外基质的主要成分,在巩膜重塑中含量减少,致使发生巩膜变薄等病理改变,最终导致近视的发生。本研究旨在利用形觉剥夺性近视动物模型,探讨miR-29在近视巩膜中的表达,并研究miR-29在人巩膜成纤维细胞中的功能与分子机制及其对近视的影响。为进一步探索近视的发病机制,治疗近视提供新的思路和方法。 方法: 1、建立豚鼠形觉剥夺性近视动物模型,实时荧光定量PCR技术研究miR-29在形觉剥夺性近视巩膜中的表达。 2、体外培养人巩膜成纤维细胞(HSF),通过基因转染技术提高miR-29在HSF中的表达。 3、MTS方法检测miR-29对人巩膜成纤维细胞增殖能力的影响。 4、生物信息学及荧光素酶报告基因分析预测miR-29的靶基因及其调控信号通路。 5、Western blot技术检测转染miR-29后其靶基因表达水平的变化,及其与靶基因相关信号通路蛋白表达水平的变化。 6、构建Dicer基因的条件性基因敲除小鼠模型,并对其进行表型分析。 结果: 1、豚鼠形觉剥夺性近视模型成功建立,miR-29在近视豚鼠巩膜中的表达明显上调。 2、MTS结果显示:转染miR-29后能够显著抑制人巩膜成纤维细胞(HSF)的增殖。 3、Western blot结果显示:转染miR-29后人巩膜成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达量均明显下降。 4、miR-29转染人巩膜成纤维细胞之后可以下调p-Akt和GSK3β的表达。 5、TGF-β处理人巩膜成纤维细胞后,可下调入巩膜成纤维细胞中miR-29的表达。 6、成功构建了眼组织特异性敲除Dicer基因的小鼠(Dicerfl/fl,Pax6-Cre+)。Dicerfl/fl, Pax6-Cre+小鼠肥胖体积较大,眼裂狭窄甚至闭合,小眼畸形,晶状体缩小并混浊,视神经萎缩变细。 结论: 结果显示我们建立了豚鼠形觉剥夺性近视模型,miR-29在形觉剥夺性近视豚鼠巩膜中的表达明显上调。转染miR-29后,人巩膜成纤维细胞(HSF)的增殖受到显著抑制,并可下调HSF细胞中Ⅰ型胶原的表达。我们再进一步探讨miR-29的作用机制时,发现在人巩膜成纤维细胞中miR-29通过作用于其靶基因collagenⅠ进一步影响了信号通路蛋白p-Akt和GSK3β的表达水平。此外,我们还发现在HSF细胞中miR-29可被TGF-β信号通路负调控。由此表明TGF-β信号通路介导miR-29调控巩膜成纤维细胞Ⅰ型胶原的合成对近视巩膜重塑有重要意义。眼组织特异性敲除Dicer基因的小鼠研究表明miRNA在眼屈光系统发育中起重要作用。