动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是40岁以上男性和绝经期后女性常见的血管病变，是心脑血管疾病的主要病理学基础。深入研究AS的发病机制及调控机制，为治疗AS寻找新的靶点及治疗方法，已成为当前研究的重要目标之一。　　在AS的发病过程中，多种细胞和因子参与了其形成，包括内皮细胞、平滑肌细胞、白细胞等。目前至少有3种关于动脉粥样硬化发病机制的学说，即脂质浸润学说、内皮损伤反应学说、血管平滑肌细胞增殖迁移学说。目前比较公认的是内皮损伤反应学说。内皮损伤反应学说认为，动脉粥样斑块的形成是动脉对内皮损伤的反应，AS病变始于内皮细胞损伤。引起内皮损伤的主要原因有高血压、剪切应力，oxLDL和胆固醇增高等，其中oxLDL是主要的损伤因素。内皮损伤可破坏内膜的渗透屏障作用和内皮表面抗血栓形成的特性、增加血管活性因子、脂解酶和生长因子释放等。因此，保护血管内皮将会在源头上抑制AS的发生发展。　　凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin like low-density lipoproteinreceptor-1，LOX-1)是不同于其他清道夫受体的、大量存在于血管内皮细胞、平滑肌细胞及肺等组织中的oxLDL特异性受体[5-6]。研究表明，oxLDL可与其受体LOX-1结合，促使LOX-1表达上调。现认为，LOX-1表达和活化在AS的全过程（从内皮活化和凋亡至斑块破裂）都存在，LOX-1上调是AS等血管性疾病的启动因素[7-8]。因此，抑制LOX-1的上调，可从源头上阻止oxLDL对血管内皮的损伤，消除损坏血管功能的触发因素，从而保护血管功能，对防止AS的发生具有重要的意义。但LOX-1的调控机制目前仍不明确。　　microRNA是一类长度为18-25bp、内源性、非编码单链小分子RNA，其序列在物种间高度保守。参与了包括生物体发育、细胞分化增殖、组织器官形成在内的多种生理和病理过程。研究表明，人类基因中有近三分之一的基因受microRNA的调控。因此，microRNA很可能参与了LOX-1表达的调控。另一方面，同其他基因的表达相似，microRNA的编码基因同样需经细胞核内转录、及修饰最后形成有功能的成熟microRNA。然而，目前对于microRNA转录调控的研究还较少。　　研究证明，microRNA与转录因子的关系十分密切。超过一半的microRNA通过调控转录因子的表达水平来实现在细胞分化、增殖、信号转导的调控功能。而在pri-microRNA的转录阶段也受到转录因子的调控，转录因子通过结合在microRNA的转录起始区域，调节pri-microRNA的转录，来达到对microRNA表达调控。MicroRNA与特定的转录因子之间组成了错综复杂的调控网络。　　由于在内皮细胞中，oxLDL可通过LOX-1及下游信号途径，引起转录因子NF-κB的活化。因此，NF-κB是否也参与了调控LOX-1的microRNA的生成，从而形成一个信号调控反馈环路，迄今未见有论文发表。　　因此我们大胆设想，在oxLDL损伤的内皮细胞中，microRNAs参与了oxLDL引起的LOX-1表达上调，并通过LOX-1/p38MAPK/NF-κB信号通路影响转录因子NF-κB的表达，进而影响内皮细胞的功能。另一方面，NF-κB又会反馈性作用于microRNA的生成，并形成是信号调控环路，在AS这一病理过程中中发挥重要的作用。　　为证明此假说，本项目拟在细胞水平通过基因转染和基因干扰等技术证实microRNA与LOX-1的关系，明确microRNA参与了oxLDL导致的内皮细胞功能及结构损伤，揭示microRNA/LOX-1/ROS/p38MAPK/NF-κB/microRNA调控环路的存在，研究将揭示microRNA与AS发生发展的关系及其信号转导途径，无疑具有理论意义和应用价值。课题的实施可望为AS的防治提供一种新思路和药物作用新靶点。　　第一部分:靶向作用于LOX-1的microRNA的筛选　　目的:筛选出靶向作用于LOX-1的microRNA。　　方法:以microrna.org、targetscan、pictar网站预测靶向作用于LOX-13'-UTR区的microRNA，选出可同时被两种及以上软件预测的microRNA;以150μg/ml的oxLDL处理内皮细胞24小时，实时定量PCR法测定oxLDL损伤的人脐静脉内皮细胞中，预测microRNA的表达变化;构建融合有LOX-13'-UTR区的双荧光报告基因载体，以双荧光报告基因检测试剂盒检测所选microRNA对双荧光报告基因表达的影响;并用实时定量PCR法测定正常内皮细胞中let-7家族表达谱;以let-7a、let-7b、let-7c mimics转染HUVEC，观察其对内皮细胞内源性LOX-1mRNA和蛋白表达的影响。　　结果:生物信息学法预测表明多个microRNA均可与LOX-13'-UTR结合，其中miR-590、miR-18b、miR-21、let-7家族可同时被两个以上软件同时预测到。以50、100、150、200μg/ml的oxLDL处理HUVEC24小时后，细胞活力分别降为原来的98.3％、73.1％、55.1％和44.3％。而150μg/ml oxLDL处理24小时后，内皮细胞中miR-590、miR-18b、let-7家族均呈现不同程度的下调，其中下调程度最大的为miR-590和let-7b，分别下降为正常对照组的24.4％和12.1％。双荧光报告基因结果表明，miR-590不能直接抑制报告基因的表达，但是let-7家族的let-7a、let-7b、let-7c、let-7g和miR-98，可明显抑制双荧光报告基因的表达。在正常培养的HUVEC中，let-7a、let-7b、let-7c的表达丰度明显高于其他成员。以75nM的let-7a、let-7b、let-7c mimics转染HUVEC后，细胞中LOX-1 mRNA和蛋白的水平均明显降低。　　结论:1、let-7a、let-7b、let-7c、let-7g、miR-98为靶向作用于LOX-1的microRNA;　　2、在HUVEC细胞中，let-7a、let-7b、let-7c的表达高于其他家族成员;　　3、let-7a、let-7b、let-7c可下调HUVEC内源性的LOX-1表达　　第二部分:let-7c/LOX-1/NF-κB信号调控环路研究　　目的:研究let-7与NF-κB的相互调控作用，并验证let-7c/LOX-1/NF-κB反馈调控环路的存在。　　方法:采用瞬时转染法使HUVEC内let-7a、let-7b、let-7c过表达Western-blot测定let-7a、let-7b、let-7c过表达后p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB p65（胞核及胞浆）蛋白表达。采用siLOX-1、NF-κB抑制剂PDTC、p38MAPK抑制剂SB203580处理HUVEC后，实时定量PCR法测定let-7a、let-7b、let-7c的改变。构建不同长度（-1.5kb，-2.0kb，-2.0kb-mut）的野生型和突变型miR-99a/let-7c启动子报告基因载体，将其分别与NF-κB p65和/或p50亚基共转染HUVEC，双荧光报告基因检测试剂盒检测报告基因荧光表达变化。采用凝胶迁移实验(EMSA)对NF-κB与miR-99a/let-7c启动子DNA的结合进行验证。以NF-κB p65和/或p50亚基转染HUVEC，实时定量PCR检测NF-κB过表达后，细胞内miR-99a和let-7c前体及成熟体表达的变化。　　结果:let-7a、let-7b、let-7c过表达后p-p38MAPK/p38MAPK分别降低为阴性对照组的0.65倍、0.58倍和0.62倍;细胞核内NF-κB(p65)占总NF-κB(p65)比例由阴性对照组的48.5％分别降低为34.8％、32.5％、20.9％; siLOX-1转染HUVEC后，实时定量PCR未能检测到LOX-1 mRNA表达，而LOX-1蛋白表达明显降低。siLOX-1、PDTC、SB203580处理HUVEC24小时后，let-7a、let-7b、let-7c表达明显降低，其中PDTC可使let-7a、let-7b、let-7c均降低为阴性对照组的1％以下。双荧光报告基因结果表明，NF-κB p65和p50均能不同程度的促进-2.0kb的报告基因的表达，而对-1643至-1652位突变的-2.0kb启动子报告基因、-1.5kb启动子报告基因作用则明显减弱。EMSA实验表明NF-κB可特异性的与miR-99a/let-7c启动子的-1643至-1652位点结合。NF-κB p65和p50过表达对HUVEC内源性的pre-miR-99a、pre-let-7c、miR-99a、let-7c具有上调的作用。　　结论:NF-κB可与miR-99a/let-7c启动子-1643～-1652位结合，直接调控let-7c的表达;let-7c/LOX-1/NF-κB之间存在负反馈调控环路　　第三部分:let-7a、let-7b、let-7c对oxLDL所致人血管内皮损伤的抑制作用及其机制研究　　目的:研究let-7a、let-7b、let-7c对oxLDL所致的内皮细胞损伤的抑制作用及机制。　　方法:以实时定量PCR法检测oxLDL不同浓度和不同时间处理HUVEC后，let-7a、let-7b、let-7c表达变化;利用let-7a、let-7b、let-7c mimics转染HUVEC，使其过表达;MTS法测定let-7a、let-7b、let-7c过表达对细胞活力的影响;细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)和一氧化氮(NO)含量采用试剂盒测定;细胞凋亡采用Hoechst33342和流式细胞术测定;细胞内活性氧含量采用DCFH-DA法测定;LOX-1和内皮型一氧化氮合酶(eNOS) mRNA采用实时定量PCR法测定;LOX-1、p38MAPK、NF-κB蛋白表达及核易位采用Western-blot法测定。　　结果:以不同浓度oxLDL处理内皮细胞24小时，或以150μg/ml的oxLDL处理细胞不同时间，可以使let-7a、let-7b、let-7c表达呈剂量或浓度依赖性的下降;oxLDL(150μg/ml)处理24小时后，细胞活力显著下降、LDH释放明显增加、NO释放明显减少;而let-7a、let-7b、let-7c过表达可不同程度的抑制oxLDL所致的上述作用。内皮细胞单独转染let-7a、let-7b、let-7c后，内皮细胞中NO水平明显上升。Hoechst染色和流式细胞术结果表明，oxLDL(150μg/ml)处理24小时后，内皮细胞凋亡率明显增加;而let-7a、let-7b、let-7c过表达可不同程度的抑制oxLDL所致的凋亡率升高。DCFH-DA染色、Western-blot和实时定量PCR结果表明，let-7a、let-7b、let-7c过表达可明显抑制oxLDL所致的ROS生成增加、p38MAPK磷酸化、PKB去磷酸化、NF-κB核易位、LOX-1表达上调和eNOS表达下调。　　结论:1）在oxLDL损伤的内皮细胞中，let-7a、let-7b、let-7c的表达被抑制，并呈时间和浓度依赖性;2）let-7a、let-7b、let-7c过表达可以对抗oxLDL所致的内皮细胞凋亡和分泌功能改变;3）let-7a、let-7b、let-7e保护内皮的作用与LOX-1/ROS/p38MAPK/NF-κB通路及LOX-1/ROS/PKB/eNOS通路有关。