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肝细胞肝癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、转移和复发率高等特点。因此，肝癌的早期诊断和对预后的准确判断对指导肝癌患者的治疗方案的制定具有重要意义。近年来，核酸类标志物逐渐成为肝癌标志物研究的热点。其中DNA甲基化作为表观遗传学的一个重要领域也被广泛深入的研究。六跨膜蛋白超家族成员1（TM6SF1）基因位于人染色体15q24-q26上，是六跨膜蛋白超家族的重要成员之一，其异常高甲基化可能与癌症的发生发展有一定的相关性。本课题组在前期的实验研究中，通过分析HCC患者的肝癌和癌旁组织的基因组学数据，发现肝癌组织中TM6SF1基因出现的高频异常改变，而且以异常甲基化为主，从而确定TM6SF1基因甲基化为本研究主要内容。 第一部分:肝癌组织中TM6SF1基因甲基化在肝癌中的诊断及预后价值 目的：本研究将检测HCC患者的肝癌和配对癌旁组织样本的TM6SF1基因启动子甲基化水平，找出甲基化差异显著的CpG位点或CpG岛，探讨TM6SF1基因异常甲基化在肝癌中的诊断价值;分析TM6SF1异常甲基化与肝癌患者临床特征的相关性以及对预后的影响。 材料与方法：1、本研究收集161例HCC患者的配对癌及癌旁组织样本，提取基因组DNA。 2、对HCC癌及癌旁组织的基因组DNA进行亚硫酸盐转化。 3、采用Sequenom平台的MassARRAYTM Nanodispenser仪，对肝癌及癌旁组织进行TM6SF1基因甲基化分析检测。 4、统计学分析采用SPSS19.0和GraphPad Prism5.0软件进行统计分析和绘图。计量资料的结果用均数±标准差表示;计量资料的组间比较采用Wilcoxon检验;计数资料的组间比较采用X2检验或Fisher精确检验。配对资料的比较采用配对t检验。诊断性分析采用ROC曲线进行分析，并计算曲线下面积(AUC)以及敏感度、特异度等诊断性指标。组间的总体生存率及无病生存率比较采用Kaplan-Meier法。用COX回归进行单因素和多因素分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。 结果：1、用MassARRAY(@)EpiTYPERTM DNA甲基化分析技术进行检测，筛选出肝癌组织中异常高甲基化的8个位于TM6SF1基因上的CpG岛及位点。 2、肝癌组织中筛选出来的8个TM6SF1基因异常高甲基化的CpG岛及位点都具有较高的诊断准确性。各ROC曲线的AUC值基本达到0.7以上。 3、8个TM6SF1基因异常高甲基化的CpG岛及位点之间具有显著正相关性，可以形成甲基化相关块区(MCBs)。 4、TM6SF1基因甲基化相关块区(MCBs)对HCC患者具有较好的诊断价值。当MCBs诊断阈值为0.155时，曲线下面积AUC=0.819，敏感性为63.9％，特异性为94.3％。 5、TM6SF1基因启动子高甲基化组的患者与低甲基化组的患者之间的构成比在年龄、性别、吸烟及饮酒史、ALT、GGT、AFP、HBsAg、HBeAg、肝硬化、癌肿大小、数量、血管浸润、肿瘤细胞分化程度、肿瘤分期等项目上均没有显著性差异(P＞0.05)。 6、TM6SF1基因启动子高甲基化组的患者与低甲基化组的患者总体生存率比较没有显著统计学差异(P=0.4502)，而高甲基化组的无病生存率显著低于低甲基化组，且差异有统计学意义(P=0.0101)。 结论：1、肝癌组织中TM6SF1基因启动子区域甲基化水平显著高于配对癌旁组织。 2、TM6SF1基因的8个候选CpG岛及位点甲基化和其组成的MCBs甲基化都具有较好的诊断准确性。 3、TM6SF1基因启动子区域高甲基化组患者的无病生存率显著低于低甲基化组;TM6SF1基因启动子区域甲基化与HCC患者术后肿瘤复发有关联性，是影响HCC患者术后复发的独立危险因素。 4、肝癌组织中TM6SF1基因上的8个异常甲基化CpG岛及位点，特别是TM6SF1_13片段的2个CpG岛，可以作为后续外周血游离DNA甲基化分析的候选位点。 第二部分 外周血游离DNA中TM6SF1基因甲基化对肝癌诊断价值的初步探索 目的：在第一部分研究的基础上分析外周血游离DNA(cfDNA)的TM6SF1基因甲基化在HCC患者、慢性乙肝患者和健康人之间的差异。初步探讨cfDNA中TM6SF1基因甲基化在肝癌中的诊断价值; 材料与方法：1、本研究纳入90例HCC患者，90例慢性乙肝患者，60例健康人，提取每组人群的血浆cfDNA。 2、进行cfDNA亚硫酸盐转化。 3、采用Pyrosequencing测序方法对外周血cfDNA的TM6SF1基因进行甲基化分析检测。 4、统计学分析采用SPSS19.0软件和GraphPad Prism5.0软件进行统计分析和绘图。成组资料采用成组t检验;计量资料结果用均数±标准差表示。诊断性分析采用ROC曲线，并计算曲线下面积以及敏感度、特异度。P＜0.05为差异有统计学意义。 结果：1、HCC患者外周血cfDNA的TM6SF1_13_CpG_23.24.25.26甲基化水平显著高于慢性乙肝患者(P=0.003)、健康对照组(P=0.0375)、以及慢性乙肝患者和健康人所组成的非肝癌人群(P=0.005); HCC患者的TM6SF1_13_CpG_27.28.29.30.31甲基化水平显著高于慢性乙肝患者(P=0.0128)，以及慢性乙肝患者和健康人所组成的非肝癌人群(P=0.0228)。 2、在区分HCC患者和慢性乙肝患者时，TM6SF1_13片段的两个CpG岛甲基化均具有较好的诊断准确性。TM6SF1_13_CpG_23.24.25.26甲基化诊断肝癌的阈值为5.54％时，AUC值为0.89，敏感性为0.93，特异性为0.80。TM6SF1_13_CpG_27.28.29.30.31甲基化诊断肝癌的阈值为4.21％时，AUC值为0.77，敏感性为0.80，特异性为0.87。在区分HCC患者和健康对照组时，TM6SF1_13_CpG_23.24.25.26甲基化的诊断性阈值为7.44％时，AUC值为0.75，敏感性为0.80，特异性为0.70。TM6SF1_13_CpG_27.28.29.30.31的甲基化的诊断性阈值为4.22％时，AUC值为0.64，敏感性为0.80，特异性为0.50。区分HCC患者和非肝癌人群时，TM6SF1_13_CpG_23.24.25.26甲基化的诊断性阈值为7.44％时，AUC值为0.84，敏感性为0.80，特异性为0.84。TM6 SF1_13_CpG_27.28.29.30.31甲基化的诊断性阈值为4.22％时，AUC值为0.72，敏感性为0.80，特异性为0.72。 结论：1、本研究建立了在外周血cfDNA中检测TM6SF1甲基化的实验流程。并初步在肝癌和对照样本中通过焦磷酸测序的方法确认TM6SF1基因在肝癌中发生高甲基化。 2、外周血cfDNA中TM6SF1甲基化对肝癌具有较好的诊断准确性，是比较理想的单基因甲基化候选标志物，也可为今后进行多基因甲基化联合诊断提供新的基因选择。