论文部分内容阅读
第一部分:LPS刺激下RAW264.7细胞中SMAC、c IAP1、TRAF3水平以及MAPK信号通路的变化目的:观察LPS刺激下,RAW264.7巨噬细胞中SMAC、TRAF3及c IAP1蛋白表达变化,并探讨对细胞MAPK信号通路的影响。方法:用100 ug/ml的LPS分别处理RAW264.7细胞0 h、1 h、2 h以及4 h后收集细胞。Western blot检测各组细胞中SMAC、c IAP1、TRAF3以及与MAPK通路密切相关的p-JNK和p-p38的蛋白表达;细胞免疫荧光技术进一步检测细胞中SMAC的蛋白表达;q RT-PCR检测细胞炎症因子TNF-α和IL-1的核酸表达。结果:(1)随着LPS处理时间的延长,细胞中SMAC和TRAF3的表达逐渐降低,c IAP1的表达逐渐升高。和LPS处理0 h相比,处理1 h、2 h、4 h后细胞中SAMC、c IAP1以及TRAF3的蛋白表达差异均具有统计学意义(P<0.05);SMAC的免疫荧光结果与Western blot结果基本一致;(2)p-JNK和p-p38的蛋白表达也随着LPS处理时间延长而逐渐升高,差异具有统计学意义(P<0.05);(3)TNF-α和IL-1的核酸表达随着LPS的处理时间延长,表达逐渐升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:在体外,LPS抑制RAW264.7巨噬细胞SMAC和TRAF3的表达,促进c IAP1的表达,并通过激活MAPK信号通路,进一步活化巨噬细胞,诱导炎症因子的释放。第二部分:Birinapant对LPS诱导的RAW264.7细胞活化的影响及机制研究目的:探讨SMAC类似物Birinapant对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞活化的影响及其分子机制。方法:用300 nmol/ml的Birinapant预处理RAW264.7巨噬细胞后,再用100ug/ml LPS刺激巨噬细胞的方式进行建模。将实验分为四组:(1)不做任何处理的空白对照组(Blank);(2)Birinapant预处理+LPS组(Birinapant);(3)只用LPS处理组(Vehicle);(4)只用Birinapant预处理不加LPS处理的对照组(Control)。Birinapant处理时间为24 h,LPS处理时间为4 h,收集各组细胞。Western blot检测各组细胞中c IAP1、TRAF3以及MAPK通路蛋白的表达;免疫共沉淀技术(Co-IP)检测TRAF3和K48泛素化的关系以及检测Birinapant组和Vehicle组TRAF3的K48泛素化水平;q RT-PCR检测细胞炎症因子TNF-α和IL-1的核酸表达。结果:(1)和Blank组相比,Vehicle组中c IAP1的蛋白表达升高,TRAF3的蛋白表达降低,此结果和第一部分研究结果一致;Birinapant组和Vehicle组相比,Birinapant组c IAP1的表达显著降低,TRAF3表达显著升高,差异均具有统计学意义(P<0.05);Control组中TRAF3和c IAP1的表达没有显著变化,无统计学差异(P>0.05);(2)TRAF3和K48泛素化直接作用,与Vehicle组相比,Birinapant组TRAF3的K48泛素化水平明显降低;(3)Vehicle组中p-JNK和p-p38的蛋白表达较高,Birinapant组与Vehicle组相比p-JNK和p-p38的蛋白表达均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);单独使用Birinapant(Control组)不会促进或者抑制JNK和p38的磷酸化(P>0.05);(4)Vehicle组TNF-α以及IL-1的m RNA相对表达量较高,与实验第一部分结果一致,加入Birinapant预处理后(Birinapant组),明显抑制了LPS介导的相关炎症因子表达,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:SMAC类似物Birinapant在体外通过抑制细胞c IAP1的表达,抑制TRAF3的K48泛素化,从而抑制TRAF3的降解,进而通过抑制MAPK信号通路的激活有效抑制LPS介导的巨噬细胞活化,减少促炎因子的产生。第三部分:LPS刺激下小鼠KCs中SMAC、c IAP1、TRAF3的水平以及MAPK信号通路的变化目的:探讨LPS刺激下,活体小鼠肝脏Kupffer细胞(KCs)中SMAC、c IAP1、TRAF3的水平变化以及对MAPK信号通路的影响,并观察LPS对小鼠肝脏损伤、肝功能以及小鼠生存率的影响。方法:(1)用腹腔注射LPS(10 mg/kg)的方式构建小鼠肝损伤模型,每组4只小鼠,每组分别处理0 h,6 h,12 h,24 h后,取下各组小鼠肝脏以及提取肝脏KCs。F4/80免疫荧光染色法鉴定KCs的纯度;台盼蓝染色法和吞墨实验分析KCs的活力及吞噬能力;Western blot检测各组KCs中SMAC、c IAP1、TRAF3以及与MAPK通路密切相关的p-JNK和p-p38蛋白表达;ELISA检测血清中TNF-α和IL-1的水平;血生化检测与肝功能密切相关的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和总胆红素(TBil)的含量;HE染色法测定肝脏组织的损伤程度;(2)取24只8周大的小鼠,随机均分为两组,一组用腹腔注射致死剂量LPS(45 mg/kg)的方式构建小鼠脓毒血症模型,另一组用等量生理盐水腹腔注射,Kaplan-Meier法进行小鼠生存分析。结果:(1)F4/80免疫荧光染色法测得KCs纯度为78.57%;台盼蓝染色法显示KCs活力在80%以上;吞墨实验可见KCs吞噬大量碳素颗粒;(2)随着腹腔注射LPS处理时间的延长,KCs中SMAC和TRAF3的表达逐渐降低,c IAP1的表达逐渐升高,和LPS处理0 h相比,处理6 h、12 h、24 h后上述蛋白表达差异均具有统计学意义(P<0.05);(3)随着LPS处理时间的延长,p-JNK和p-p38的蛋白表达逐渐升高;血生化和ELISA检测显示,LPS刺激下小鼠血清中TNF-α、IL-1、ALT、AST以及TBil的含量明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05);(4)HE染色结果显示LPS诱导小鼠肝脏损伤;(5)实验组(LPS致死剂量组)小鼠中位生存期为36.0 h,72 h的存活率仅为16.7%,对照组(注射等量生理盐水)所有小鼠在观察时间内未出现死亡。结论:(1)在体内,LPS抑制KCs中SMAC和TRAF3的表达,促进c IAP1的表达,并通过激活MAPK信号通路促进炎症因子的释放,诱导肝脏损伤及肝功能异常;(2)致死剂量LPS可以显著缩短小鼠生存时间。第四部分:Birinapant对LPS诱导的KCs活化、小鼠肝损伤以及小鼠生存率的影响及其分子机制目的:探讨SMAC类似物Birinapant对LPS诱导的KCs活化、小鼠肝损伤和小鼠生存率的影响及其分子机制。方法:(1)将实验分为两个大组,每大组各20只小鼠:(1)实验组(Birinapant)小鼠预先用Birinapant(30 mg/kg)腹腔注射处理;(2)对照组(Vehicle)小鼠用等量生理盐水腹腔注射。两组小鼠在喂养24 h后,再将两大组小鼠分别分为五小组,每小组4只小鼠,均以腹腔注射LPS(10 mg/kg)的方式构建动物模型,LPS的处理时间分别为0 h,1 h,3 h,6 h和12 h。Western blot检测各组KCs中c IAP1、TRAF3以及与MAPK通路密切相关的p-JNK和p-p38蛋白表达;免疫共沉淀技术检测Birinapant组和Vehicle组TRAF3的K48泛素化水平;免疫组化检测肝脏组织中TRAF3和c IAP1的蛋白表达;ELISA检测血清中TNF-α和IL-1的水平;血生化检测ALT、AST和总胆红素TBil的含量;HE染色测定肝脏的损伤程度。(2)将24只小鼠随机分为两组,每组各12只:(1)实验组小鼠预先用Birinapant(30mg/kg)腹腔注射;(2)对照组小鼠用等量生理盐水腹腔注射。两组小鼠在喂养24 h后,用腹腔注射致死剂量LPS(45 mg/kg)的方式构建小鼠脓毒血症模型,记录各组小鼠生存时间,Kaplan-Meier法分析小鼠的生存情况。结果:(1)Vehicle组小鼠在腹腔注射LPS后,KCs中c IAP1的表达显著升高,TRAF3的表达显著降低,且呈时间依赖性。而Birinapant组c IAP1和TRAF3的表达无显著变化,Vehicle组和Birinapant组相比,c IAP1以及TRAF3在两组相同时间点的蛋白表达水平具有统计学差异(P<0.05);(2)免疫共沉淀结果显示TRAF3和K48泛素化直接作用,与Vehicle组相比,Birinapant组TRAF3的K48泛素化水平明显降低;(3)TRAF3和c IAP1的免疫组化结果和Western blot的结果基本一致;(4)Birinapant组能够显著抑制LPS介导p38和JNK的磷酸化;(5)血生化和ELISA检测显示,Birinapant组与Vehicle组相比,血清中TNF-α、IL-1、ALT、AST以及TBil的含量明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);(6)Birinapant能够抑制LPS诱导的肝脏损伤;(7)Birinapant预处理组小鼠中位生存期为58.0 h,72 h的存活率为75.0%;对照组小鼠在腹腔注射致死剂量的LPS后中位生存期为36.0 h,72 h的存活率仅为16.7%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)Birinapant通过抑制活化的KCs中c IAP1的表达,抑制TRAF3的K48泛素化,从而抑制TRAF3的降解,通过抑制MAPK信号通路的激活,抑制促炎因子的释放,有效减轻肝脏炎症反应和肝脏组织损伤;(2)Birinapant有效延长脓毒血症小鼠的生存时间。