论文部分内容阅读
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是黄病毒科(Flaviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)成员，引起牛病毒性腹泻-黏膜病(BVD-MD)，症状主要表现为腹泻，急、慢性黏膜病，持续性感染与免疫耐受，免疫抑制，母畜流产、死胎和畸胎等。该病主要发生于牛，还可感染猪、羊、鹿、骆驼及其它野生反刍动物。牛病毒性腹泻黏膜病呈世界性分布，我国目前已有二十个省市自治区存在本病。由于我国对BVDV的危害性缺乏足够重视，目前尚缺少相应的疫苗，也没有完善的牛病毒性腹泻的诊断、监测技术，面对该病在我国有逐步扩大的趋势，开展BVD／MD的诊断和检测技术的研究迫在眉睫。BVDV的非结构蛋白p80在瘟病毒属中非常保守，是一种免疫优势蛋白，在自然感染或者弱毒活疫苗免疫后的动物中都可以产生针对p80蛋白的抗体，具有重要的诊断价值。 本研究将p80基因分成三段，参照GenBank上发表的BVDV VEDEVAC株基因序列(序列号为AJ585412)设计三对引物，应用PCR方法扩增出p80的三段基因片段，分别命名为p80A基因片段(939bp)、p80B基因片段(570bp)和p80C基因片段(672bp)。分别克隆至pMD-18-T载体，构建重组质粒pMD18-T-p80A、pMD18-T-p80B、pMD18-T-p80C。测序结果表明p80A、p80B、p80C基因片段与VEDEVAC株基因序列(序列号为AJ585412)的同源性分别为99.15％、98.95％和99.85％。推导氨基酸的同源性分别为99.04％、98.42％和100％。 利用DNA重组技术，将BVDV p80A、p80B和p80C基因片段分别亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上，重组质粒分别命名为pGEX-6P-p80A、pGEX-6P-p80B和pGEX-6P-p80C。将上述重组质粒转化至工程菌Rosetta(DE3)pLyss和BL21(DE3)pLysS中，在IPTG诱导下重组质粒pGEX-6P-p80A、pGEX-6P-p80B和pGEX-6P-p80C均得到成功表达。Western blowing分析表达的三个融合蛋白，结果显示，只有p80B基因片段(289-477aa)表达的融合蛋白能与牛病毒性腹泻的阳性血清反应，表明p80蛋白的免疫优势区域集中在289-477aa区域，位于p80蛋白的解旋酶区域。 蛋白的可溶性分析显示，p80B基因片段蛋白表达产物主要以包涵体形式存在。对包涵体进行提取及切胶纯化，用纯化蛋白作抗原，初步建立间接ELISA方法，结果显示，p80B基因片段表达的融合蛋白能用作ELISA的诊断抗原，用于检测BVD抗体。本实验为进一步开发诊断p80抗体的试剂盒研究工作奠定了基础；同时该方法可以作为与基因工程亚单位疫苗匹配的鉴别诊断方法，能有效的区分动物的疫苗免疫和自然感染，为BVDV的净化提供技术手段。