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[背景与目的]急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia, AML)的特殊亚型,全反式维甲酸成功诱导APL细胞分化使其从最高危成为完全可能治愈的一种急性白血病,然而维甲酸耐药是临床诱导治疗失败的原因之一。葛根总黄酮(Puerariae radix flavones, PRF)是中药葛根主要活性成分,课题组前期研究发现较低浓度(10~50μg/ml) PRF对急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞有增殖抑制作用,并能诱导凋亡。其分子机制与MAPKs凋亡途径中的JNK、p38和ERK通路中相关信号分子有关。进一步研究发现10~50μg/ml PRF联合1μM三氧化二砷(asenic trioxide, ATO)干预NB4细胞能更有效抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,上调NB4细胞中JNK表达。基于课题组上述研究结果,本研究以维甲酸耐药细胞株NB4-R1细胞为研究对象,探讨10~50μg/ml PRF联合ATO对NB4-R1细胞凋亡的影响,并进一步验证JNK相关信号通路在诱导维甲酸耐药细胞凋亡中可能的作用。[方法]1.0、10、30、50μg/ml PRF单独或分别联合1μM ATO和0.5μM ATO作用于NB4-R1细胞24、48、72小时,MTT法检测细胞增殖抑制率。根据IC50值筛选合适的作用时间及浓度;2.0、10、30、50μg/ml PRF单独或分别联合1μM ATO和0.5μM ATO作用于NB4-R1细胞48小时,流式细胞术(FITC-Annexin V/PI双染法)检测细胞早期凋亡率改变;3.0、10、30、50μg/ml PRF单独或联合1μM ATO作用于NB4-R1细胞48小时,蛋白印迹法(Western Blot)检测JNK通路相关蛋白变化。[结果]1.不同浓度PRF对NB4-R1细胞有增殖抑制作用 MTT结果示0、10、30、50μg/mlPRF能够抑制NB4-R1细胞增殖,并呈浓度和时间依赖性;PRF作用于NB4-R1细胞24、48、72小时IC50分别为238.09、56.75、35.95μg/ml; 1μM ATO对NB4-R1细胞有增殖抑制作用,与PRF联合抗增殖作用强于PRF单药。具有统计学意义(P<0.05)。在此基础上进一步下调ATO浓度,采用ATO单独或分别联合10、 30、50μg/ml PRF处理NB4-R1细胞后,增殖抑制率与PRF单药组相比变化不显著(P>0.05)。2.细胞凋亡率的改变0、10、30、50μg/ml PRF作用于NB4-R1细胞48小时,流式细胞术检测细胞早期凋亡率分别为1.5%、1.5%、2.4%、4.9%;与1μM ATO联合干预NB4-R1细胞48小时,细胞早期凋亡率分别为6.0%、12.6%、12.9%、19.3%;与0.5μM ATO联合处理NB4-R1细胞48小时,细胞早期凋亡率分别为2.5%、5.0%、5.0%、6.3%。提示早期凋亡率随浓度升高而增加,且PRF和ATO存在协同促凋亡作用。3.PRF诱导的NB4-R1细胞凋亡相关蛋白表达0、10、30、50μg/ml PRF干预NB4-R1细胞48小时,随着细胞凋亡的增加,JNK、p-JNK、cleaved caspase-3表达上调,p38、ERK1/2、pro-caspase 3、pro-caspase 9、p53表达下调。[结论]较低浓度PRF(10~50μg/ml)能抑制维甲酸耐药细胞株NB4-R1细胞增殖并诱导凋亡,与浓度和时间呈正相关,且与ATO存在协同促凋亡作用。初步证明PRF诱导凋亡的作用靶点可能与维甲酸受体无关,其分子机制可能与激活MAPKs途径中JNK信号通路,同时下调p38和ERK信号通路有关。