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第一部分靶向线粒体氧化应激对AGEs诱导髓核细胞凋亡的作用及机制研究目的:探讨线粒体途径在AGEs诱导NP细胞凋亡过程中的作用机制,并明确靶向线粒体氧化应激在该过程中的治疗作用。方法:采用免疫组织化学染色检测人体NP组织标本中AGEs水平,并与相应椎间盘退变等级进行相关性分析;体外实验中经AGEs刺激或Mito TEMPO/SKQ1预处理培养人原代NP细胞,采用Ed U染色检测NP细胞增殖活力,并采用Annexin V-APC/7-AAD染色、TUNEL染色检测NP细胞凋亡,Western Blotting检测细胞凋亡指标cleavedcaspase3;钙黄绿素-AM染色检测线粒体膜通透性,JC-1染色检测线粒体膜电位,Western Blotting检测线粒体外膜通透蛋白(Bcl-2、Bax)和细胞色素C水平,DCFHDA探针装在检测细胞内ROS水平。结果:NP组织内AGEs沉积水平与椎间盘退变等级呈明显正相关;体外AGEs刺激培养NP细胞证实AGEs可明显抑制NP细胞增殖活性,并诱发NP细胞凋亡;AGEs刺激可明显增加NP线粒体膜通透性,促使线粒体内细胞色素C溢漏至细胞质内;靶向线粒体抗氧化剂Mito TEMPO/SKQ1预处理,可明显缓解AGEs诱导的NP细胞氧化应激水平,降低线粒体膜通透性,抑制AGEs诱导的NP细胞凋亡。结论:线粒体功能障碍是AGEs诱导NP细胞凋亡的重要途径,靶向线粒体氧化应激可明显改善NP细胞线粒体功能,进而抑制AGEs诱导的NP细胞凋亡。第二部分SIRT3调控线粒体氧化还原稳态在AGEs诱导髓核细胞凋亡中的作用及机制研究目的:探讨AGEs对NP细胞线粒体抗氧化系统的影响,并进一步探索SIRT3调控线粒体氧化还原稳态对AGEs诱导NP细胞凋亡的作用及机制。方法:采用Western Blotting检测NP细胞线粒体氧化还原酶的蛋白水平;采用Western Blotting检测人NP组织标本和NP细胞内SIRT3蛋白水平;经SIRT3干扰RNA转染和过表达慢病毒感染构建NP细胞SIRT3功能丢失和获得实验,并采用Mito SOX染色检测NP细胞线粒体ROS水平,并与Mito Tracker染色进行共定位;采用Annexin VAPC/7-AAD染色检测NP细胞凋亡。结果:体外AGEs刺激培养NP细胞证实AGEs可明显降低NP细胞线粒体氧化还原酶的蛋白水平;NP组织内SIRT3蛋白水平与椎间盘退变等级呈明显负相关,与AGEs沉积水平呈明显负相关;AGEs可明显降低NP细胞内SIRT3蛋白水平和去乙酰化酶活性;SIRT3功能丢失和获得实验证实SIRT3对维持NP细胞线粒体氧化还原酶水平至关重要,并可调控线粒体氧化还原稳态进而缓解NP细胞凋亡。结论:线粒体抗氧化系统水平下降是AGEs沉积环境诱发NP细胞氧化应激的重要机制,其中SIRT3蛋白功能障碍与该过程密切相关;靶向恢复SIRT3蛋白功能,不仅可有效恢复NP细胞线粒体氧化还原稳态,还可明显缓解AGEs诱导的NP细胞凋亡。第三部分烟酰胺单核苷酸经SIRT3和线粒体途径调控髓核细胞凋亡的机制及其对椎间盘退变的作用研究目的:探讨烟酰胺单核苷酸NMN对NP细胞SIRT3功能和氧化还原稳态的调控作用及机制,并明确其对IDD的治疗作用。方法:采用Western Blotting检测NP细胞AMPK-PGC-1α通路和线粒体氧化还原酶的蛋白水平;经A-769662、Compound C、RAGE中和性抗体、NMN与AGEs共培养NP细胞,或SIRT3干扰RNA预转染后,采用Western Blotting检测NP细胞AMPK-PGC-1α通路、线粒体氧化还原酶和SIRT3的蛋白水平,Mito SOX染色检测NP细胞线粒体ROS水平,并与Mito Tracker染色进行共定位,Annexin V-APC/7-AAD染色检测NP细胞凋亡;经SD大鼠尾部椎间盘注射构建AGEs沉积退变模型,采用MRI、苏木精-伊红和番红-固绿染色观察椎间盘组织形态,Western Blotting和免疫荧光染色检测SIRT3和cleaved caspase3蛋白水平,TUNEL染色检测细胞凋亡。结果:体外AGEs刺激培养NP细胞证实AGEs可明显抑制NP细胞内AMPK-PGC-1α通路活化水平;NMN可明显激活NP细胞内AMPK-PGC-1α通路,增加线粒体氧化还原酶的蛋白水平,进而恢复NP细胞氧化还原稳态,缓解AGEs诱导的NP细胞凋亡,SIRT3功能丢失实验证实SIRT3在该过程中的必要性;NMN注射可明显缓解AGEs诱导的SD大鼠尾部椎间盘NP细胞凋亡和退变。结论:NMN可激活AMPK-PGC-1α通路,增加NP细胞内SIRT3和线粒体氧化还原酶的蛋白水平,恢复NP细胞线粒体氧化还原稳态,在缓解AGEs诱导的NP细胞凋亡和IDD进展具有重要作用。