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目的:通过替莫唑胺(TMZ)在体外分别对O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)有活性的T98G及无活性的U87MG两种细胞系进行药物敏感性实验、凋亡敏感性实验,以及通过对MGMT基因不同活性的T98G及U87MG进行替莫唑胺(TMZ)与MGMT直接抑制剂O6-苄基鸟嘌呤(O6-BG)、替莫畔胺(TMZ)与周期非特异性化疗药顺铂(CDDP)、替莫唑胺(TMZ)与小分子靶向药物伊马替尼(imatinib)联合用药的相互作用效果进行观察,探讨联合用药提高恶性胶质瘤细胞对TMZ敏感性的可行性。
方法:采用PCR方法测MGMT基因启动子区CpG岛甲基化情况,判定MGMT活性。采用Hoechst33342/PI双染法根据细胞核形态及细胞核染色情况进行检测细胞的凋亡,根据镜下观察计算凋亡率,凋亡率(%)=凋亡细胞数/总体细胞数×100%。MTT法检测TMZ、O6-BG、CDDP、imatinib单独用药或TMZ联合O6-BG、TMZ联合CDDP、TMZ联合imatinib对T98G及U87MG两种细胞系增殖的影响。用Chou-Talalay的电脑分析软件评价联合用药的作用性质。
结果:在PCR实验中T98G扩增出两条带,即MGMT甲基化及MGMT未甲基化两条带,U87MG扩增出一条带,即MGMT甲基化条带,证明T98G细胞具有MGMT活性而U87G不具有MGMT活性。在Hoechst33342/PI双染法获得的诱导率比较中证实TMZ在U87MG细胞中诱导的凋亡明显多于T98G细胞。MTT结果显示,TMZ在U87MG细胞中的IC50浓度明显小于T98G细胞,为T98G的四分之一;T98G联合使用TMZ与O6-BG的IC50浓度明显小于单独使用TMZ的IC50浓度值;而U87MG细胞中TMZ与O6-BG联合用药,Icso浓度与单独使用TMZ的IC50浓度值无显著差异。Chou-Talalay的电脑分析软件评价联合用药的相互性质表明:在T98G细胞中:TMZ与CDDP联合用药在有效率(Fa)<0.8时联合指数(CI)值小于1,当有效率(Fa)为0.5时,TMZ浓度由单独应用时的1.8mmol/L降到0.3mmol/L,联合用药与单独用药相比节省的药物浓度倍数(DRI)值为5.66,CDDP浓度由单独应用时的3.7μmol/L降到0.6μmol/L,联合用药与单独用药相比节省的药物浓度倍数(DRI)值为5.7,联合指数(CI)值为0.35,呈协同作用;TMZ与imatinib联合用药在有效率(Fa)0.45时联合指数(CI)值小于1,当有效率(Fa)为0.5时,TMZ浓度由单独应用时的1.8mmol/L降到1.1mmol/L,联合用药与单独用药相比节省的药物浓度倍数(DRI)值为1.62,imatinib浓度由单独应用时的13.1μmol/L降到4.51μmol/L,联合用药与单独用药相比节省的药物浓度倍数(DRI)值为2.89,联合指数(CI)值为0.9,呈协同作用。在U87MG细胞中:TMZ与CDDP联合用药在有效率(Fa)>0.55时朕合指数(CI)值大于1。当有效率(Fa)为0.5时,TMZ浓度由单独应用时的0.4mmolFL降到0.14mmol/L,联合用药与单独用药相比节省的药物浓度倍数(DRI)值为2.9,CDDP浓度由单独应用时的3.8umol/L降到2.2umol/L,联合用药与单独用药相比节省的药物浓度倍数(DRI)值为1.7,联合指数(CI)值为0.93呈叠加作用;TMZ与imatinib联合用药在所有有效率(Fa)范围中均未出现协同作用,当有效率(Fa)为0.5时,TMZ浓度由单独应用时的0.4mmol/L升到0.56mmol/L,联合用药与单独用药相比节省的药物浓度倍数(DRI)值为0.7,联合指数(CI)值为1.65,呈拮抗作用。
结论:TMZ对MGMT无活性U87MG细胞的药物敏感性更高。TMZ对MGMT无活性的U87MG细胞更容易诱导凋亡。对于MGMT有活性的T98G细胞联合应用TMZ与MGMT直接抑制剂O6-BG联合具有协同作用,TMZ与周期非特异性化疗药CDDP联合除在较大浓度具有拮抗作用外其联合起协同作用、TMZ与小分子靶向药物imatinib联合在达到半数杀伤效果时出现协同作用,为进一步研究探讨临床联合用药治疗恶性胶质瘤的可能性打下良好基础。