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蟾酥是由蟾蜍的耳廓和皮肤腺中提取的一种白色分泌物,是中国的传统中药,被广泛的应用于东亚国家。蟾酥的药理活性强,具有抗肿瘤、利尿、镇痛、抗炎等作用。近年来,蟾酥复方制剂被证明在治疗心血管疾病方面有显著疗效。含有蟾酥的复方制剂已成为临床上治疗心血管疾病的常用药物。蟾毒灵（Bufalin）是蟾酥当中蟾毒内酯类化合物的一种,其化学结构是在原有的蟾毒内酯类化合物母核上以R2取代基为甲基,除R2外,R1-8取代基为H取代。近年来,虽然有很多研究集中在蟾酥中有效成分的含量测定,但是蟾毒灵的含量测定结果却不甚一致。本研究采用高效液相色谱技术（HPLC）,以乙腈-0.5%磷酸二氢钾溶液为流动相,反相Altima C18色谱柱为固定相检测蟾毒灵在蟾酥中所占比重。有关蟾毒灵的药理学研究主要集中在其抗肿瘤活性方面,其对心肌作用的研究相对少见。本课题采用酶解法分离大鼠心室肌细胞,利用全细胞膜片钳技术（Whole cell Patch Clamp technique）和细胞收缩及离子浓度同步测量系统（IonOptix）来检测蟾毒灵对心肌细胞膜L型钙通道,以及心肌收缩力的作用。目的:检测蟾酥中蟾毒灵的含量,以及蟾毒灵对大鼠心肌细胞钙通道和心肌收缩力的影响。方法:通过高效液相色谱法测定蟾毒灵在蟾酥当中的含量,并采用全细胞膜片钳技术和IonOptix测量系统从电生理的角度上观察蟾毒灵对心肌细胞L型钙电流及心肌细胞收缩力的影响,从而探究蟾毒灵心脏保护的细胞学机制。结果:1 HPLC法测定蟾酥中蟾毒灵的含量1.1仪器和色谱条件高效液相色谱仪:Waters e2695 Separations Module检测器:2489 UV/Vis Detector色谱条件:以乙腈-0.5%磷酸二氢钾溶液为流动相,反相Altima C18色谱柱为固定相,检测波长:296 nm;流速:1.0ml·min-1;柱温:40℃;进样量:20μl。通过高效液相色谱法以乙腈-0.5%磷酸二氢钾溶液为流动相,反相Altima C18色谱柱为固定相,检测波长:296 nm;流速:1.0ml·min-1;柱温:40℃;进样量:20μl,通过线性回归方程计算得出蟾毒灵在蟾酥中大约占比3%。1.2方法学考察蟾毒灵在0.554μg-3.324μg具有良好的线性关系,线性回归方程和相关系数为:y=636816x-4631.1,R2=0.9999,n=6。平均回收率为99.48%,RSD为1.0167%。色谱条件方法学显示,精密度、重复性和稳定性都较好。2大鼠心室肌细胞L型钙电流(ICa-L)的确定用全细胞膜片钳技术稳定记录到大鼠的心室肌细胞电流后,分别用含尼卡地平（钙通道阻滞剂）、氯化镍（T型钙通道阻滞剂）、维拉帕米（L型钙通道阻滞剂）的台氏液灌流后发现,用尼卡地平台氏液（Nicardipin,Nic）灌流后电流基本被阻断,说明检测到的是钙电流。用含氯化镍（NiCl2）的台氏液灌流后,电流无明显变化,说明所记录的钙电流并非T型钙电流。用含维拉帕米（Verapamil,Ver）的台氏液灌流,电流完全被阻断,说明所记录的钙电流为L型钙电流。3蟾毒灵对心室肌细胞ICa-L的抑制作用蟾毒灵（300μM）以剂量依赖性的方式抑制ICa-L,用台氏液回冲后,钙电流基本保持稳定。由量效曲线计算得出蟾毒灵的半数抑制浓度(IC50)为60μM。蟾毒灵（300μM）也可以抑制由钙激活剂Bay K8644（10μM）激活的ICa-L。4蟾毒灵对ICa-L电流-电压（I-V）关系曲线的影响蟾毒灵（3,30,300μM）可随浓度的增高使I-V曲线上移,但并不影响电流-电压关系。5蟾毒灵对心室肌细胞ICa-L稳态激活和失活曲线的影响通过绘制给药前及给予不同浓度的蟾毒灵（3和30μM）的心室肌细胞ICa-L的稳态激活和失活曲线,发现30μM的蟾毒灵可以使稳态失活曲线的V1/2向超极化方向移动。6蟾毒灵对大鼠心室肌细胞收缩的影响测定结果显示100μM的蟾毒灵可以明显抑制心室肌细胞的收缩,抑制率为33.83±4.01%。结论:本研究通过高效液相色谱技术准确的测定了蟾酥中蟾毒灵的含量,并从电生理的角度探讨了蟾毒灵的心脏保护学机制。研究结果表明蟾毒灵在蟾酥中大约占比3%,其可浓度依赖性的抑制大鼠心室肌细胞ICa-L,抑制心室肌细胞收缩,从而在一定程度上发挥了保护心肌的作用。