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第一部分造血细胞自噬与骨质疏松症的临床相关性观察目的:观察临床骨质疏松症人群造血细胞功能与骨密度相关性。方法:分析2013-2018年苏州大学附属第二医院体检中心4979名健康人群体检血常规和骨密度相关性,选取数据均已排除肿瘤等恶性疾病。髋关节置换手术和膝关节置换手术中抽取股骨骨髓30例,分离单个核细胞,检测造血细胞自噬功能以及调控自噬活动关键基因表达与患者骨密度相关性。抽取骨髓的入组条件是创伤导致的骨折或骨关节炎关节置换手术。排除条件包括:继发性骨质疏松症、既往使用过抗骨质疏松药物治疗、既往造血系统疾病、恶性肿瘤、糖尿病、甲状腺相关疾病及其他恶性疾病。结果:4979名健康人群体检结果红细胞计数和髋部骨密度成正相关,骨质疏松症患者红细胞计数相比于非骨质疏松症患者显著下降(p<0.05),与性别无关。骨质疏松症患者骨髓调控自噬相关基因Atg7、Atg5、Atg12、Lc3b、Lamp2a、P62表达下调(p<0.05)。骨质疏松症患者骨髓造血细胞自噬功能受抑制,表现为骨髓CD45阳性的造血细胞和骨髓CD34阳性的造血干细胞中LC3和溶酶体共定位减少,与骨质疏松症患者骨髓造血细胞调控自噬相关基因表达减少一致。结论:骨质疏松症人群红细胞计数减少;骨质疏松症患者骨髓造血细胞自噬功能受抑制。第二部分骨质疏松小鼠模型造血细胞功能异常目的:为了验证第一部分临床骨质疏松症患者骨髓造血自噬功能异常的现象,本实验利用骨质疏松小鼠模型探究骨量下降和造血细胞自噬的关系。方法:使用卵巢去势小鼠骨质疏松模型及其对照组,骨髓单个核细胞通过流式细胞检测分析得到造血干祖细胞,检查造血干祖细胞、造血干细胞占骨髓细胞比例,Annexin V&PI法检测造血细胞凋亡,通过蛋白印迹法(Western Blot)检测造血细胞调控自噬功能的蛋白P62,LC3表达,流式成像法检测造血细胞自噬功能。使用铁蓄积骨量下降小鼠模型及其对照组,铁蓄积骨量下降小鼠模型通过腹腔注射枸橼酸铁铵构建,铁蓄积小鼠及其对照组骨组织通过micro-CT检测骨量变化,收集骨髓单个核细胞,流式细胞检测分析造血干祖细胞,检查造血干祖细胞数量比例,细胞凋亡,流式成像法检测造血细胞自噬功能。结果:卵巢去势小鼠模型流式细胞检测造血干祖细胞比例增加,凋亡比例增加,造血干细胞占造血干祖细胞比例减少(p<0.05),Western Blot结果提示卵巢去势小鼠P62蛋白积聚,LC3-I型蛋白向LC3-II型蛋白转化受抑制,流式成像结果显示造血干细胞和单个核细胞自噬小体功能受抑制。铁蓄积小鼠模型micro-CT显示骨量下降,流式细胞检测铁蓄积小鼠造血干祖细胞比例增加,细胞凋亡比例增加(p<0.05),流式成像结果显示造血细胞自噬小体功能受抑制,与卵巢去势骨质疏松小鼠的骨髓细胞改变类似。结论:卵巢去势和铁蓄积两种小鼠骨质疏松模型造血干祖细胞异常增生,造血细胞自噬功能受抑制。动物体内实验验证骨质疏松症和造血细胞自噬异常具有相关性。第三部分造血细胞自噬必需基因缺失导致骨量下降目的:为了解释骨质疏松症人群和骨质疏松小鼠模型中造血细胞自噬异常现象,本实验使用造血细胞条件性敲除Atg7基因小鼠,研究骨组织表型。方法:Atg7基因是细胞自噬必需基因,构建造血细胞条件性敲除Atg7基因小鼠Atg7flox/flox;Vav-Cre(本文以Atg7-/-表示),Western Blot验证骨髓造血细胞和骨组织ATG7蛋白表达,micro-CT检测小鼠骨密度和骨组织空间结构参数,包括骨密度、骨小梁数目、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁空间、皮质骨厚度。扫描电镜观察骨小梁空间结构,钙黄绿素双标染色检测骨矿化沉积率,鬼笔环肽抗体染色观察长骨干骺端形态,H&E染色和Masson染色观察骨组织形态,三点力学检测骨组织机械应力形状改变,茜素红/阿尔新蓝染色观察胚胎小鼠骨骼发育情况。骨组织冰冻切片染色鬼笔环肽染色观察骨细胞形态结构,Mitotracker Deep Red染色观察骨细胞线粒体量改变,γ-H2AX染色观察骨细胞DNA损伤。流式细胞检测分析骨组织氧化应激水平。提取骨组织RNA,RT-PCR检测调控成骨分化和骨吸收的相关基因包括Sp7、Runx2、Bmp2、Bmp6、Ctsk、Trap5。结果:Western Blot结果显示Atg7-/-小鼠骨髓组织ATG7蛋白不表达,LC3-I型蛋白向LC3-II型蛋白转化受抑制,骨组织ATG7蛋白正常表达。Micro-CT结果显示造血细胞Atg7基因敲除小鼠骨量下降,骨密度减低,骨组织空间结构参数提示骨密度、骨小梁数目、骨体积分数、骨小梁厚度、皮质骨厚度减少(p<0.05),骨小梁空间不变。扫描电镜发现Atg7-/-小鼠骨小梁结构破坏,钙黄绿素双标显示Atg7-/-小鼠骨矿化沉积率下降(p<0.05),鬼笔环肽染色显示Atg7-/-小鼠干骺端形态异常,H&E染色显示Atg7-/-小鼠骨小梁稀疏,结构破坏,Masson染色显示Atg7-/-小鼠骨组织弹性纤维和胶原纤维减少,三点应力实验显示Atg7-/-小鼠骨组织生物力学减弱,最大负荷、最大压强、硬度显著下降(p<0.05)。茜素红/阿尔新蓝染色显示Atg7-/-小鼠胚胎骨骼发育无异常。骨组织冰冻切片染色显示Atg7-/-小鼠骨细胞数量减少,线粒体量增多,DNA损伤增多(p<0.05)。Atg7-/-小鼠骨组织氧化应激反应水平增加(p<0.05)。Atg7-/-小鼠骨组织Runx2、Bmp2、Bmp6、Ctsk、Trap5基因表达下调(p<0.05)。结论:造血细胞自噬异常导致骨量下降,骨生成受抑制,与骨组织氧化应激反应水平增高有关。第四部分造血细胞自噬异常导致骨量下降的组学机制分析目的:在发现造血细胞自噬异常会导致骨量下降基础上,本实验继续使用造血细胞Atg7基因敲除小鼠探究造血细胞如何调控骨组织代谢。方法:(1)转录组测序分析:收集Atg7-/-小鼠胫骨股骨骨髓,进一步分离收集造血干祖细胞,对骨髓造血干祖细胞进行转录组测序;(2)蛋白组测序分析:Atg7-/-小鼠胫骨股骨冲掉骨髓,骨质进行蛋白质谱分析,通过KEGG分析、SRING分析研究骨代谢相关蛋白表达变化,根据蛋白质谱结果进行免疫组化验证。结果:转录组学结果提示,造血细胞自噬缺失小鼠骨髓造血干祖细胞调控骨细胞分化活动的m RNA表达减低,调控钙离子活动的m RNA表达减低,调控铁代谢活动的m RNA表达增加;蛋白质谱结果生物学分析显示Atg7-/-小鼠骨组织胶原纤维合成、软骨内骨形成、骨生成蛋白表达显著下调;KEGG和STRING分析提示自噬异常抑制collagen家族表达,影响细胞外基质(ECM)受体相互作用。免疫组化结果验证Atg7-/-小鼠骨组织collagen1表达下降。结论:造血细胞异常减低细胞外基质通路collagen1表达,抑制骨生成活动。第五部分造血细胞自噬异常导致骨组织H型血管受损目的:研究骨组织H型血管(CD31hi EMCNhi)与造血系统自噬下降和骨代谢异常的关系,本实验使用造血细胞Atg7基因敲除小鼠探究骨组织H型血管变化。方法:Atg7-/-小鼠骨组织提取RNA,检测VEGF家族表达,Atg7-/-小鼠胫骨冰冻切片使用CD31、EMCN和DAPI染色,鉴定骨组织H型血管。结果:Atg7-/-小鼠骨组织Vegfa的m RNA表达下调(p<0.05),Vegfb和Vegfc表达无统计学差异。Atg7-/-小鼠骨组织H型血管减少。结论:造血细胞自噬异常通过减少Vegfa抑制骨组织H型血管,导致骨量下降。