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DNA中的胞嘧啶甲基化修饰是一种表观遗传标记，它对于很多生物学过程非常重要，如基因和转座子的沉默、基因印记等。RNA介导DNA甲基化途径(RNA(d)irected(D)NA(M)ethylation，RdDM途径)是植物中主要的从头DNA甲基化途径。经典的RdDM途径主要包括两个步骤:第一步是24nt siRNA的产生，该过程需要依赖于DNA的RNA聚合酶-PolⅣ、依赖于RNA的RNA聚合酶-RDR2和DCL3蛋白等作用。第二步是从头DNA甲基化。在24nt siRNA进入AGO4/6蛋白后通过碱基互补配对结合PolⅤ转录的scaffold RNA后，招募从头DNA甲基化酶-DRM2介导DNA甲基化。 为了更好的理解24nt siRNA在RdDM途径中的作用，利用亚硫酸盐测序方法获得了RdDM途径相关突变体的全基因组DNA甲基化水平，包括PolⅣ（nrpd1）和DICER LIKE家族蛋白(dcl1/2/3/4)缺失等突变体。通过数据分析所有的RdDM位点中，有84.5％的位点的DNA甲基化作用是部分或完全不依赖DICERs。同时，数据表明不依赖于DICERs的RdDM位点周围富集了H3K27mel和H3K9me2等异染色质组蛋白修饰。然而，依赖于DICERs的RdDM位点的周围却倾向富集更高水平的常染色质组蛋白修饰，如:H3K4me2、H3K4me3、H3K36me2和H3k36me3。 更为重要的是，通过P4RNAs测序方法，发现在dcl2/3/4和dcl1/2/3/4突变体中大量累积了依赖于PolⅣ和长度为25-50nt的P4RNAs。进一步分析得到大约有68％的野生型中的24nt siRNA的Reads序列包含在dcl1/2/3/4突变体里的25-50nt的P4RNAs Reads序列中，说明P4RNAs是24nt siRNA的前体RNA和PolⅣ的转录本。此外，进一步发现在dcl1/2/3/4突变体中DNA甲基化水平与P4RNAs积累水平呈正相关性。因此，实验证明大多数RdDM位点上的DNA甲基化是不依赖于DICERs作用产生21-24nt siRNA，而是依赖于PolⅣ产生的非编码P4RNAs。然而，24nt siRNA只是对部分RdDM位点上的DNA甲基化的维持起作用。 有趣的是，我们还发现了dcl1突变体相对WT表现为高DNA甲基化表型，说明DCL1蛋白在全基因组DNA甲基化过程中起到抑制作用。同时还发现在dcl1突变体中的高DNA甲基化位点上有24nt siRNA的积累。此外，RdDM途径中的突变体能够消除dcl1突变体中的高DNA甲基化表型。以上说明了DCL1蛋白阻止DNA甲基化的新作用机制可能是直接切割PolⅣ转录本从而阻止了RdDM途径起作用。