【摘 要】
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该研究项目即拟通过基因打靶技术破坏α1,3半乳糖基转移酶基因;或通过转染人CD59基因抑制补体激活.最后将经过基因修饰的细胞以核移植技术克隆为符合临床移植要求的动物个体.
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该研究项目即拟通过基因打靶技术破坏α1,3半乳糖基转移酶基因;或通过转染人CD59基因抑制补体激活.最后将经过基因修饰的细胞以核移植技术克隆为符合临床移植要求的动物个体.该报告的内容为整个研究的前期工作.第一部分 猪胚胎成纤维细胞分离培养及表达αGal补步鉴定以胰蛋白酶消化法分离、培养、传代及冻存猪胚胎成纤维细胞.并通过RT-PCR方法,证实所培养的猪胚胎成纤维细胞内存在α1,3半乳糖苷转移酶基因转录.第二部分 猪α1,3半乳糖苷转移酶基因克隆:根据已发表的猪α1,3半乳糖苷转移酶cDNA序列及相关资料,设计引物,以上海生工公司提供的TaqPLUS酶对猪的基因组进行扩增,获得7.0kb、7.5kb、9.0kb左右的片段,连接于T-easy载体,测序分析,确定了它们在猪α1,3半乳糖苷转移酶全基因上的位置.第三部分转人CD59基因猪胚胎成纤维细胞的建立:利用脂质体LipofecTAMIN将质粒DNA pGFP-C1-CD59和空载体DNA pGFP-C1导入猪胚胎成纤维细胞内,经G418筛选10天后可见抗性细胞克隆出现,初步证明转染成功.并进行PCR检测,只在转染质粒DNA pGFP-C1-CD59的猪胚胎成纤维细胞内成功扩增,进一步证实人CD59基因已成功转染猪胚胎成纤维细胞.
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