研究背景胃癌（Gastric cancer,GC）是我国最常见的消化道肿瘤之一,占据全球每年新发病例的一半左右。早期胃癌可以通过内镜下治疗或手术治疗达到较好的预后。但是在我国80%以上患者初诊时已处于进展期,预后效果差,多以放化疗或者其他支持治疗为主。在胃癌的一线治疗中大都以嘧啶类药物和铂类药物的双联疗法为主,但是治疗效果欠佳,患者生存获益受限。2010年ToGA研究首次发现以HER2为治疗靶点的药物曲妥珠单抗联合一线化疗方案可以显著提高胃癌患者总生存,降低患者死亡率,这开启了胃癌靶向治疗的探索之路。截止目前,曲妥珠单抗仍是HER2阳性胃癌一线唯一有效的靶向药物,尚无其他的靶点药物可以替代。然而,令人遗憾的是,随着治疗的进行,患者大都出现了曲妥珠单抗耐药。疾病一旦进展,目前尚无针对性的后线治疗策略,一方面曲妥珠单抗的跨线治疗在胃癌中宣告失败;另一方面在乳腺癌中取得成功的其他靶向HER2的药物如拉帕替尼和TDMI在胃癌中也以失败告终。因此,有必要深入探究胃癌中曲妥珠单抗的耐药机制,以期寻找促进曲妥珠单抗治疗有效和延迟耐药发生的有效策略,给患者带来生存的获益。目前针对曲妥珠单抗耐药的机制主要集中在肿瘤细胞本身,现有研究发现肿瘤细胞HER2的缺失、药物靶向HER2的阻断、HER2旁路信号的激活以及下游信号通路的激活都是导致曲妥珠单抗耐药的关键。肿瘤组织是由肿瘤微环境的各种成分共同组成,而不仅仅是肿瘤细胞本身。早在上世纪90年代就有学者通过在小鼠体内构建多种化疗药物的耐药模型,分离出构建成功的耐药肿瘤细胞,但在体外给予药物刺激,发现仍对药物具有一定的敏感性。2006年Dalton团队首次提出微环境介导的耐药（Environment-mediated drug resistance,EMDR）这一概念。然而,EMDR在曲妥珠单抗中的作用却鲜有报道。曲妥珠单抗本身除了抑制HER2靶点阻断下游信号外,还能通过NK细胞发挥抗体介导的细胞毒作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）,现有研究也提示曲妥珠单抗具有激活杀伤性免疫细胞促进抗肿瘤的作用;另一方面一些研究提示了糖代谢和脂代谢异常与曲妥珠单抗的耐药关系,而代谢重编程作为癌症的特征之一,参与调控肿瘤微环境的各种功能和表型。因此有必要深入探究代谢-免疫交互作用介导的微环境变化在曲妥珠单抗耐药中的作用。既往在乳腺癌分子亚型中检测谷氨酰胺代谢相关蛋白的表达,发现在HER2阳性乳腺癌中谷氨酰胺代谢活性最高。在一篇关于HER阳性胃癌曲妥珠单抗敏感和耐药细胞代谢组测序的文章中提示,无论是在NCI-N87还是在MNK45耐药细胞中,差异代谢物均可显著富集在谷氨酰胺及谷氨酸代谢通路。这提示我们谷氨酰胺代谢途径可能与曲妥珠单抗的耐药相关。另一方面,现有研究提示谷氨酰胺代谢可以通过调控微环境的代谢重塑影响免疫微环境调控肿瘤生长。因此有必要探究谷氨酰胺代谢驱动的免疫微环境在曲妥珠单抗耐药中的作用。研究方法和结果1.谷氨酰胺分解代谢增加与曲妥珠单抗耐药选取HER2阳性的胃癌细胞NCI-N87和SNU216以及构建成功的曲妥珠单抗耐药细胞株,进行转录组测序发现耐药细胞富集谷氨酰胺代谢通路。通过qRT-PCR、WB检测谷氨酰胺分解代谢指标、GLS1酶活性以及代谢产物检测,发现曲妥珠单抗耐药细胞中谷氨酰胺分解代谢水平增加,且以GLS1高表达为主。通过MTT以及流式细胞凋亡检测发现体外联合GLS1抑制剂可以部分逆转曲妥珠单抗的耐药;将敏感和耐药细胞打入小鼠皮下成瘤,发现GLS1抑制剂联合曲妥珠单抗可以明显降低耐药组的肿瘤大小,且耐药组织中的酶活性和代谢产物水平明显升高。2.肿瘤细胞与巨噬细胞的谷氨酰胺代谢交互调控巨噬细胞表型转换介导曲妥珠单抗耐药收集HER2阳性胃癌曲妥珠单抗敏感和耐药的患者进行转录组测序,分析发现耐药患者中谷氨酰胺代谢水平增加,通过免疫组化和免疫荧光检测微环境细胞标记蛋白与GLS1蛋白,定位巨噬细胞高表达GLS1。通过流式细胞术和免疫组化发现耐药微环境中M2型巨噬细胞比例明显增加。分别沉默肿瘤细胞与巨噬细胞的GLS1表达后行共培养实验,通过WB和qRT-PCR明确肿瘤细胞对巨噬细胞GLS1表达的调控作用。进一步将野生及耐药肿瘤细胞共培养巨噬细胞,通过qRT-PCR和流式细胞术检测发现耐药组巨噬细胞表型以M2为主;鸡胚绒毛尿囊膜血管实验（CAM）实验证明耐药组促血管生成增加;肿瘤细胞加入GLS1抑制剂后巨噬细胞GLS1表达减少,M2表型降低,血管生成减少。3.肿瘤细胞通过分泌GLS1微囊泡促进巨噬细胞GLS1表达和M2表型收集肿瘤细胞来源的条件培养基共培养巨噬细胞,通过qRT-PCR以及流式细胞术检测发现巨噬细胞表型以M2为主。差速分离法提取肿瘤细胞上清中的细胞外囊泡,进行透射电镜负染和WB检测微囊泡标记蛋白;肿瘤细胞爬片后扫描电镜观察和免疫荧光共聚焦检测微囊泡标记蛋白实验确定肿瘤细胞可以分泌GLS1微囊泡,且耐药株显著。使用细胞外囊泡抑制剂GW4869作用肿瘤细胞后与巨噬细胞共培养,通过WB和qRT-PCR检测巨噬细胞GLS1表达降低,qRT-PCR和流式细胞术检测巨噬细胞M2表型减少,CAM实验发现血管生成减少。4.耐药肿瘤细胞通过CDC42激活IQGAP1和NFκB p65促进GLS1微囊泡分泌通过WB和免疫荧光发现耐药细胞中CDC42表达增加,使用CDC42抑制剂ZCL278后微囊泡分泌减少。通过构建CDC42突变体,G12V（GTP酶锁定型）和T17N（GDP酶锁定型）,WB和免疫荧光检测微囊泡标记蛋白指标,发现微囊泡分泌与CDC42激活状态相关。一方面通过核质分离技术以及免疫荧光等手段明确CDC42通过调控NFκB p65在曲妥珠单抗耐药细胞中激活,且参与了调控GLS1的表达和曲妥珠单抗的药物敏感性;另一方面,通过免疫共聚焦以及CO-IP实验表明CDC42通过下游分子IQGAP1协同GLS1复合物形成促进GLS1微囊泡的分泌。5.基于曲妥珠单抗耐药微环境建立ABM模型及联合治疗策略的探究通过构建多尺度ABM模型,包括分子尺度的HER2信号通路及其下游的细胞周期通路,细胞尺度的肿瘤细胞与巨噬细胞的表型转换、血管内皮细胞的激活等,微环境尺度涉及α-KG、EGF、VEGF、NO、IL-6、IL-10等细胞因子及代谢物,组织尺度的血管对营养物质、药物的运输及新生血管的生成。通过模型建了曲妥珠单抗治疗反应以及曲妥珠单抗耐药的模型,基于曲妥珠单抗耐药模型探究了抗谷氨酰胺代谢、抗血管生成以及M1巨噬细胞治疗的联合策略效果。研究结论本项研究基于转录组测序、分子生物学以及体内动物实验发现了肿瘤细胞内升高的谷氨酰胺代谢促进了曲妥珠单抗耐药,同时肿瘤细胞通过分泌GLS1微囊泡促进巨噬细胞M2表型和血管生成导致耐药。机制上,肿瘤细胞通过激活CDC42,一方面调控NFκB p65激活入核转录调控GLS1表达;一方面通过IQGAP1调控GLS1微囊泡的分泌。基于曲妥珠单抗耐药微环境呈现高谷氨酰胺代谢高M2极化免疫高血管生成的交互作用构建数学模型,有策略的选择抗代谢抑制剂、抗血管生成治疗以及抗巨噬极化的治疗可能为逆转曲妥珠单抗的耐药提供新的见解。