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乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)是困扰我国人民健康的重要传染性疾病,其中相当一部份发展成为慢性乙型肝炎,有些还可能进一步演变为肝硬化、肝细胞癌等。目前临床上常使用拉咪呋叮(3TC)与干扰素-α(IFN-α)治疗慢性活动性乙型肝炎。其中3TC是逆转录酶抑制物,能显著下调患者体内病毒核酸水平;而IFN-α是一类同时具有免疫调节和抗病毒作用的细胞因子类药物,临床资料表明IFN-α能下调病毒蛋白表达,调节免疫反应,促进抗体产生,但是有效率不到40%。对HBV能否拮抗以及如何拮抗IFN-α抗病毒效应,近年来国内外众多实验室进行了研究并已获得具有一定意义的结果,如发现慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞对IFN-α反应性明显弱于健康对照,MxA蛋白诱生障碍;进一步研究发现HBV前Core或Core蛋白可结合MxA基因上游启动子,从而抑制MxA蛋白表达。另外对IFN-α耐药的乙型肝炎患者先使用3TC降低病毒滴度后再给予IFN-α治疗,可以提高IFN-α疗效。以上结果提示HBV与IFN-α间存在相互作用,而且这种相互作用可能是多方面的。可以推测HBV可能通过病毒复制和蛋白表达对干扰素诱生与效应信号通路中的关键环节进行干预,使内源性干扰素产生不足或干扰素抗病毒效应被拮抗,从而导致感染慢性化以及对IFN-α的治疗不敏感。多角度深入研究HBV与IFN-α相互作用的机制有可能有助于加深对HBV慢性感染机制的认识。为此,本课题拟利用体外HBV稳定和短暂复制细胞系统,通过改变HBV复制状态,比较HBV不同复制水平下细胞内IFN信号通路与相关效应基因表达的变化以揭示HBV复制和蛋白表达对干扰素相关信号通路的影响,并初步探索其分子机制。
本研究首先建立了可模拟HBV不同复制和蛋白表达水平的细胞系统,包括经3TC处理的原可持续分泌病毒抗原和进行病毒基因复制的HepG2.2.2.15、瞬转具有不同复制能力的HBV质粒和编码病毒Pol蛋白质粒的Huh-7细胞。实验发现,3TC可明显抑制HepG2.2.2.15细胞内病毒核酸复制,对Core蛋白水平也有一定程度的抑制作用,但对病毒的S抗原、E抗原等病毒蛋白无明显抑制作用;野生型HBV质粒在细胞内可启始HBV基因复制,HBV复制缺陷型HBV质粒在细胞内则不发生HBV基因的复制。
在此基础上,对HBV不同复制水平下细胞内IFN信号通路与相关效应基因表达的变化进行了研究。结果发现,在3TC处理后、HBV基因复制受到明显抑制的情况下,HepG2.2.2.15细胞对IFN-α刺激的反应性可得到不同程度恢复,表现为内源性ISGs表达上调,IFN信号通路荧光报告系统指示信号通路活化强度变大,提示HBV复制与细胞对IFN-α的反应性存在一定相关性。进一步应用瞬转两种具有完全不同复制能力HBV质粒的细胞比较其对IFN-α的反应性,结果发现复制缺陷型HBV对IFN-α信号通路诱导表达的荧光酶的抑制效应弱于野生型HBV,但恢复其复制能力后抑制IFN-α信号通路的效应仍可得到加强,进一步提示在HBV拮抗IFN系统的作用中,病毒基因复制因素可能发挥重要作用。由于在HBV基因复制受到抑制时Core蛋白的水平也出现一定程度下降,而体外单独瞬转HBV复制酶Pol也发现细胞对IFN-α的应答性亦出现下降趋势,可以推测HBV的Core蛋白和病毒复制酶Pol均可能参与HBV对IFN信号通路的拮抗作用。为明确HBV对IFN信号通路中JAK-STAT信号通路的影响,本研究进一步检测了不同HBV复制水平的细胞中STAT1蛋白的表达及磷酸化情况,结果发现:与未处理组相比,3TC处理后、HBV基因复制受到明显抑制的HepG2.2.2.15细胞在受IFN-α刺激后其STAT1蛋白表达以及磷酸化水平并未得到显著加强,这提示HBV抑制IFN-α信号通路的作用可能通过其它环节进行。
综上所述,本研究结果表明HBV在细胞内复制时可干扰IFN诱发的信号通路,其中Core蛋白和病毒复制酶Pol可能发挥了重要作用。然而这一干扰作用可能与STAT1诱导性表达及其磷酸化水平无关,提示IFN-α信号通路的其它环节可能受到影响。对此现象的深入研究有可能揭示HBV拮抗干扰素的分子机制,丰富细胞信号转导机制以及对人类基因功能等的认识,并可能为优化临床治疗方案提供理论依据。