目的:人生长激素释放激素(h GHRH)由下丘脑分泌,促进垂体合成和释放人生长激素(h GH)。前原蛋白h GHRH(1-107/8)的成熟由一系列蛋白水解加工步骤,最终的成熟形式是h GHRH(1-44)NH2,h GHRH(1-37)OH和h GHRH(1-40)OH,但其半衰期短和活性低是主要限制。最近研究发现,h GHRH(1-44)分子的N-端1Tyr→Pro-1Pro-或1Pro-延伸或代换,和C端GGC延伸的同源二聚体意外表现出比h GHRH(1-44)NH2更高的生长激素释放活性。本论文主要研究四种新型h GHRH二聚体结构和生物活性之间的关系,为后续进一步动物体内实验研究奠定基础。方法:1 GHRH类似物单体的化学合成和鉴定以固相多肽合成技术合成新型N端和(或)C端改构的GHRH单体肽,其分子量用ESI MS进行鉴定,纯度用C18-反相HPLC进行鉴定。2 GHRH二聚体的形成和鉴定GHRH单体肽在p H=11.5的氨水溶液中,37℃保温60小时后形成二聚体肽,冻干后用肽-PAGE电泳进行纯度鉴定。3 GHRH二聚体肽刺激垂体激素分泌的体外活性分析S-D雌鼠12:12小时明暗交替饲养,饲养温度26±1℃。大鼠经断颈处死,在30分钟内摘取全部脑垂体。用灭菌的lactated Ringer’s buffer(LRB)冲洗后,垂体立即放到内有1 ml LRB的玻璃管中,37℃保温。玻璃管总保温5 h,每1小时后,轻轻吸出试管里面的缓冲液,同时加入1毫升新鲜的缓冲液。从第3小时保温(I3,I4,I5)开始,连续加入1.927μM h GHRH活性多肽。收集的标本用ELISA测定大鼠垂体激素GH、ACTH、LH和PRL。4大鼠垂体生长激素释放抑制分析根据垂体GH释放活性试验(P1,P2,I3,I4,I5),在I3-I5保温中,分别添加0.482或1.927μM的生长激素抑制激素(GHIH)于含有1.927μM GHRH二聚体的管中。无肽P2保温做空白和S肽做标准对照。大鼠垂体GH水平用r GH ELISA试剂盒测定。5 GHRH二聚体肽体外受体结合反应取30只S-D雌鼠的新鲜垂体,匀浆缓冲液研磨重悬,Bradford法测蛋白浓度。在测试中,每孔分别加入100μl垂体匀浆液,5种不同浓度的荧光标记二聚体肽和对应的非标记GHRH二聚体,总体积300μl。每个测试重复2次,用荧光检测仪在490/525 nm波长下测荧光值。6大鼠垂体组织荧光染色分析福尔马林固定S-D大鼠垂体组织切片染色,染色方法如下:玻片浸泡在HEPES缓冲液3次,每次5分钟。在组织切片上滴加200μl含有76±1荧光强度的FITC-GHRH二聚体的HEPES缓冲液,37℃下孵育1小时。用HEPES缓冲液洗涤两次后,在切片上滴加DAPI水溶液(0.01克/毫升),37℃孵育15分钟。将切片洗涤后用荧光封固剂封片。此染色过程在暗环境中进行。结果:1 h GHRH类似物的纯度和分子质量反相高效液相色谱法分析h GHRH的纯度均大于95%,电喷雾质谱仪法分析肽的分子质量与实际分子质量一致。聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析h GHRH二聚体肽的纯度达到实验要求。2 h GHRH肽对大鼠垂体激素的释放活性2.1大鼠GH释放活性:以S肽的净r GH作为基准,2F或2Y肽的净r GH值在统计学上具有显著性差异(P<0.05)。2F或2Y的最大净GH值比S肽高出30.6或36.5%。2D,2E,2F和2Y的活性分别为S肽的104±16.7%,94±32.6%,114±16.6%和122±14.5%。2F肽的I3值在统计学上比其P2或S肽的I3更高(P<0.01)。2Y肽的I5的r GH孵育值高于S肽的I5的r GH孵育值(P<0.01)。2.2 h GHRH类似物对垂体其它激素释放活性的分析:与标准S肽一样,GHRH二聚体肽没有增加垂体ACTH、PRL和LH的释放。3大鼠垂体GH释放抑制试验在5小时垂体保温试验中,在I3-I5孵育期间加入1.927μM的GHRH二聚体肽,0.482或1.927μM的GHIH,对大鼠GH的释放产生了明显的抑制效果。与不加肽的P2值比较,在I3-I5孵育期的低值数据表明,GHIH具有明显的抑制的大鼠GH释放作用,且具有剂量和时间依赖关系(P<0.05或0.01)。4 GHRH二聚体肽与垂体GHRH受体结合试验S,2D,2E,2F和2Y肽与大鼠垂体细胞的受体进行特异性结合反应显示具有较高的特异性。h GHRH肽的结合强弱为2F>2D>2Y>2E>S,因而2F肽具有最大的垂体匀浆结合力(P<0.05)。5大鼠垂体组织荧光染色经FITC标记的GHRH二聚体肽染色分布于细胞膜上,荧光染色的强度为2F>2D>2E>2Y>S,其中2F肽在垂体细胞膜上的分布最强。结论:1通过大鼠GH释放/抑制活性分析、受体结合试验以及组织化学染色可以看出,h GHRH二聚体肽的2D,2E,2F和2Y具有良好的大鼠GH释放活性和相似的垂体激素释放特异性。2 2F具有最强的和最持久的活性,最强的垂体匀浆结合能力,垂体细胞染色中表现最为明显,这表明在垂体细胞膜上2F肽和GHRH受体之间的亲和力最强。因此,2F肽可以成为将来动物试验的一个不错的选择。3在GHRH促使GH方面释放,两个N末端GHRH二聚体肽比一个N末端的h GHRH﹙1–44﹚NH2的效果更好。