目的：　　通过制备一种多层石墨烯水凝胶薄膜为研究平台，对石墨烯材料的体内外成骨生物学特性做出准确评估，并检测其作为屏障膜引导骨再生修复大鼠颅骨缺损和犬拔牙创位点保存的能力。使用多层石墨烯水凝胶薄膜与多层石墨烯干燥薄膜进行比较，揭示石墨烯材料的纳米结构对其骨再生性能的影响，推进石墨烯材料的构建和生物学应用。　　方法：　　1.使用真空过滤技术，制备多层石墨烯水凝胶薄膜，应用扫描电镜观察材料表面的纳米形貌，X射线衍射测定多层石墨烯水凝胶薄膜的化学表征，万能力学测试机对材料进行力学性能的检测，接触角测试仪对材料的亲水性进行检测。　　2.使用扫描电镜和荧光显微镜观察大鼠骨髓基质干细胞在材料表面粘附情况，荧光显微镜测量细胞在材料上的增殖能力，骨架蛋白染色检测了材料表面细胞形态，活/死细胞双染色测定材料的细胞毒性，活性氧检测证实细胞在材料表面的代谢情况，评价材料的生物相容性。　　3.通过扫描电镜和荧光显微镜检测磷灰石在材料表面的沉积能力，酶标测试仪检测材料吸附蛋白的能力，检测材料的生物活性。　　4.通过骨钙素免疫荧光、碱性磷酸酶活性和茜素红染色检测大鼠骨髓基质干细胞在多层石墨烯水凝胶薄膜表面的成骨分化能力。　　5.大鼠皮下植入多层石墨烯水凝胶薄膜，检测术后12周内大鼠体重和主要器官的改变，材料在体内的组织学反应以及材料的降解情况；将大鼠骨髓基质干细胞接种在多层石墨烯水凝胶薄膜表面，植入大鼠皮下，观察材料在体内对干细胞的成骨诱导能力，表达骨钙素荧光的水平。　　6.比较多层石墨烯水凝胶薄膜及多层石墨烯干燥薄膜作为引导骨再生屏障膜，修复大鼠颅骨缺损的骨再生性能，通过Micro-CT检测颅骨缺损区域内新生骨的数量和质量，荧光序列标记评价骨形成和骨矿化的速度，组织学检测新生骨组织的体积百分比、新生骨成熟程度和材料的降解表现。　　7.检测多层石墨烯水凝胶薄膜作为屏障膜，行beagle犬拔牙窝位点保存的引导骨再生能力。通过CBCT检测手术后6个月拔牙窝位点的牙槽嵴高度和宽度，组织学观察拔牙窝的新生骨组织情况。　　结果　　1.通过真空过滤得到多层石墨烯水凝胶薄膜，扫描电镜显示材料为一个均匀的多层和褶皱状的纳米结构；水凝胶薄膜呈现优异的机械特性，具有平均拉伸模量（69±5）MPa的机械强度；材料的接触角为(64.63±1.50)°，亲水性较佳。　　2.扫描电镜显示大鼠骨髓基质干细胞呈扁平状紧贴在多层石墨烯水凝胶薄膜表面，骨架蛋白染色显示干细胞为成骨细胞形态；荧光显微镜显示干细胞能在材料表面正常增殖，活/死细胞双染色显示材料表面的细胞绝大多是绿色的活细胞，只有极少数被染成红色，为死细胞；干细胞在材料表面接种24小时后，活性氧水平要低于盖玻片上的细胞，显示多层石墨烯水凝胶薄膜的良好生物相容性。　　3.多层石墨烯水凝胶薄膜的蛋白吸附量（256.01±24.15）μg/m2显著高于其干燥对照，多层石墨烯水凝胶薄膜在浸泡模拟体液后，其表面具有更明显的磷灰石沉积，Ca/P比达到(1.52±0.23)，显示材料具有很好的生物活性。　　4．无论在成骨诱导液还是生长培养液中，多层石墨烯水凝胶薄膜上的骨髓基质干细胞的骨钙素免疫荧光染色阳性，碱性磷酸酶活性显著增高，茜素红染色阳性，明确了细胞成骨分化的增强。　　5.大鼠皮下植入的多层石墨烯水凝胶薄膜周围可以看到一层薄薄的纤维包裹和新生的血管。植入术后12周内大鼠的体重和主要器官均无明显改变，材料两端开始碎裂，可见多核异物巨细胞和大量丰富的血管组织，植入材料的厚度在体内随着观察时间的增加而变厚，提示材料在体内开始溶涨。多层石墨烯水凝胶薄膜在体内还可以将干细胞诱导分化为成骨细胞，表达骨钙素的红色荧光。　　6.大鼠颅骨缺损修复术后观察，多层石墨烯水凝胶薄膜停留在缺损部位；Micro-CT分析结果显示在多层石墨烯水凝胶薄膜组中，在水凝胶薄膜下的颅骨缺损部位,有大量的新骨形成并均匀分布，骨体积分数和骨密度也显著高于其他实验组，具有最高的骨小梁厚度（0.30±0.06) mm和最小的骨小梁分离（0.22±0.10） mm；荧光标记的动态形态学观察分析表明，多层石墨烯水凝胶薄膜组相比于钛膜组和对照组，具有更高的2-4周（2.96±0.86）μm/d和4-6周（2.73±0.81）μm/d的矿化沉积率；组织学分析显示，多层石墨烯水凝胶薄膜组中的颅骨缺损基本已被新生骨组织填满，其新骨面积百分比要显著高于钛膜组和空白组。结果显示多层石墨烯水凝胶薄膜的纳米结构更能促进骨再生。　　7.犬拔牙窝位点保存术后6个月，犬的恢复情况良好，术区牙槽嵴丰满，未见明显凹陷；CBCT图像显示多层石墨烯水凝胶薄膜组颊侧骨壁顶点要更接近于舌侧骨壁顶点，颊侧和舌侧的垂直骨高度均要显著高于空白对照组，牙槽嵴顶下1毫米处的舌侧骨宽度也要显著高于其他两组；组织学分析显示多层石墨烯水凝胶薄膜组的新骨面积百分比达到（86.25±9.10）%，显著高于空白对照组，拔牙创包含板层骨、编织骨、哈佛氏管、血管、骨髓腔等结构，相对比较成熟。　　结论　　1.我们的自支撑式多层石墨烯水凝胶薄膜，具有波浪状和皱褶状的纳米表面形貌、优异的机械强度、较高的亲水性，是一种很好的骨组织再生的候选生物材料。　　2.本课题使用了多层石墨烯水凝胶薄膜作为研究平台，证实了石墨烯材料良好的生物相容性、生物活性、骨诱导性和降解性。揭示了石墨烯在生物医学应用中具有很大的潜力，可以作为一个“智能”的生物材料用于骨再生。　　3.多层石墨烯水凝胶薄膜作为生物屏障膜能有效地引导骨再生，修复大鼠颅骨缺损；适当的多层纳米结构能够改善石墨烯材料的性能，包括机械性能、柔韧性以及选择渗透性等使石墨烯材料能够更好地促进成骨细胞粘附、蛋白吸附和磷灰石沉积，增强成骨生物活性，促进骨再生修复。　　4.多层石墨烯水凝胶薄膜具有和谐的机械性能、骨引导性和骨诱导性、选择渗透性和生物活性，能够有效地保存拔牙窝位点，为石墨烯材料成为单独使用的生物活性屏障膜提供理论基础，以及颌面部骨缺损修复提供新一代安全而有效的生物材料。