促红细胞生成素(Epo)是一种促进红系造血前体细胞分化、繁殖的细胞因子,在临床上主要用于治疗慢性肾功能衰竭(CRF)、艾滋病人及肿瘤病人化疗引起的贫血等,疗效极为显著。Epo是一种含有166个氨基酸的糖蛋白,糖基对于蛋白质的稳定性维持和体内活性至关重要。目前临床使用的重组人促红细胞生成素(rhEpo)均为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的糖蛋白,但CHO表达体系生产成本高、产量低,而大肠杆菌表达系统具有生长速度快、周期短、培养条件简单、价格低廉等优点。虽然以大肠杆菌表达的无糖链促红细胞生成素(rh-ngEpo)丧失了体内生物活性,但是这一点可以通过PEG修饰技术来弥补。PEG修饰通过减少肾清除、降低免疫原性、减少酶解等改善蛋白药物的药代动力学性质,提高蛋白药物的循环半衰期,增强体内药效,目前已成功用于多种蛋白药物的长效制剂研发。为实现对蛋白质N末端的定点修饰和提高蛋白修饰后的活性保留,本论文采用分子量为20 kDa和30 kDa的单甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)对rh-ngEpo进行修饰。论文考察了各种反应条件对修饰效果的影响,得到了最佳反应条件,即在4℃时,20 mmol/LPB,0.5 mol/L甘露醇,pH 6.0溶液中,蛋白浓度为1 mg/mL, PEG/rh-ngEpo摩尔比为10：1,NaBH3CN/PEG摩尔比为10：1,反应24 h后,单修饰率可达到55%。用一步离子交换色谱法对反应混合物进行分离纯化,得到纯度在95%以上的单修饰产物。对单修饰产物理化性质和修饰位点进行研究,发现其二、三级结构与原蛋白一致。肽图分析表明绝大部分的PEG修饰在了蛋白N-末端氨基酸残基上。ELISA活性分析表明单修饰产物的体外活性比修饰前分别减少了30%和45.6%。稳定性实验表明PEG修饰显著增强了原蛋白的热稳定性。药代动力学实验结果表明PEG提高了rh-ngEpo的代谢稳定性。综上所述,我们优化了mPEG-ALD修饰rh-ngEpo的最佳反应条件,有效分离出单修饰产物,确定了偶联产物的结构、理化性质及药代动力学性质,研究结果表明PEG可以在一定程度上替代糖基的作用。PEG修饰的非糖基化Epo有望成为一种新型的促红细胞生成蛋白药物。