番茄SlE6L1基因在果实成熟中的功能研究

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番茄是一种重要的果蔬作物,富含人体所需的多种营养物质,如维生素、糖类及矿物质元素等。番茄具有基因组体积小、基因组信息全面、简单的二倍体遗传、生命周期短、易种植、易转化等优点,已作为模式植物用于科学研究。番茄果实成熟是一个复杂而高度有序的过程,伴随着果实风味、质地、色泽以及糖类、氨基酸、有机物和芳香物质的变化。番茄果实成熟的分子机制一直是科学研究的热点。MADS-box家族转录因子RIN在果实成熟过程中具有广泛的调控功能,但其靶向调控路径仍有待深入研究。本研究在前人研究的基础上,筛选出一个在野生型番茄中FCWT高达13.4,而在突变体rin中FCrin仅为0.4的基因SlE6L1(FC表示基因在破色期相对于绿熟期表达量的差异倍数),暗示该基因的表达可能依赖于RIN。通过RNA干扰技术获得独立的SlE6L1沉默转基因植株,研究SlE6L1在番茄果实成熟中的生物学功能及调控机制。获得的主要结果有:(1)生物信息学分析显示,SlE6L1编码的蛋白质由342个氨基酸组成,其N端含有一个分泌性信号肽;SlE6L1蛋白质与棉花E6和拟南芥E6L1蛋白质具有高度相似的序列,说明SlE6L1属于E6-like成员,这与Inter Pro数据库中“Protein E6-like”的分类一致;启动子分析表明,SlE6L1基因启动子区含有5个MADS-RIN识别的靶基序CAr G-box和3个乙烯响应元件。此外,烟草瞬时表达实验表明,MADS-RIN能够结合SlE6L1的启动子并直接激活该基因的表达。(2)组织表达模式分析表明,SlE6L1在野生型番茄B+7、B+4和B时期果实中大量表达,在茎、根、萼片、幼叶、花、成熟叶、衰老叶、未成熟绿色果实(IMG)和成熟绿色果实(MG)中表达量较低;相比于野生型,SlE6L1在突变体rin和Nr果实中的转录水平显著下调,尤其在rin中几乎不可检测;我们还发现1-甲基环丙烯(1-MCP)处理野生型MG果实中,SlE6L1基因的表达水平明显降低。暗示SlE6L1可能在乙烯的调控下参与番茄果实成熟。(3)构建SlE6L1基因的沉默表达载体,通过农杆菌转化野生型番茄,成功获得了SlE6L1沉默植株。筛选出沉默效率为92%-95%的株系用于后续实验研究。(4)沉默SlE6L1导致番茄果实成熟推迟,B+4和B+7果实果皮呈现橙红色,番茄红素和总类胡萝卜素含量明显降低,类胡萝卜素代谢途径相关基因PSY1、PDS和ZDS的表达水平显著下调,而CYCB、LCY-E和LCY-B的表达水平明显上调。以上结果暗示,SlE6L1影响番茄果实成熟过程中的总类胡萝卜素代谢途径。(5)实时荧光定量PCR分析发现,SlE6L1-RNAi株系中果实成熟相关基因ERF4、PG和CNR的表达量明显低于野生型,而RIN、FUL1和FUL2没有显著性差异。此外,SlE6L1沉默果实中乙烯合成相关基因(ACS2,ACO3和ACO1)和乙烯响应基因(E8和E4)的表达显著降低。所以SlE6L1可能通过调节乙烯及果实成熟相关基因的表达进而影响番茄果实成熟。乙烯三重反应显示,SlE6L1基因的下调增强了番茄幼苗对乙烯的敏感性。(6)SlE6L1-RNAi果实中总果胶和纤维素含量均明显升高,细胞壁代谢相关基因的表达(XTH5、PL、EXP1和TBG4)显著下调。此外,SlE6L1沉默株系果实中可溶性糖和淀粉含量有所升高,ADP-葡萄糖焦磷酸化酶编码基因(Sl AGPase L1,Sl AGPase L3和Sl AGPase S1)、淀粉合成酶编码基因(Sl STS1,Sl STS4和Sl STS6)和淀粉分支酶编码基因(Sl SBE1)的表达水平显著上调。以上结果表明,SlE6L1可能影响了番茄果实成熟过程中的多种代谢途径。综上所述,SlE6L1作为MADS-RIN的直接靶基因参与调控番茄果实成熟,并影响了类胡萝卜素代谢、细胞壁代谢及乙烯敏感性。
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