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猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）给世界养猪业带来巨大经济损失，而目前涉及到PRRSV复制过程的分子机制仍不甚明了。其中，ORF5a蛋白是PRRSV最近鉴定出的结构蛋白。我们在实验室已经拥有的PRRSV全长感染性克隆的基础上，证实ORF5a基因为两型PRRSV复制所必须。接下来，对ORF5a蛋白的结构与功能及与其它结构蛋白相互作用关系等进行了解析，促进了对动脉炎病毒及PRRSV复制过程的进一步了解。 本研究具体内容如下: 1、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4/ORF5区间基因插入研究 为解决当前PRRSV弱毒疫苗无法区分野毒感染和疫苗接种的问题。实验以JXM100为骨架构建的全长感染性克隆为基础，在不影响亚基因5结构的情况下在ORF4/ORF5区间插入3～6个碱基，构建ORF4/ORF5区间基因插入突变克隆pAJXMin3、pAJXMin4、pAJXMin5、pAJXMin6。通过转染BHK-21细胞进行病毒拯救，发现插入3或6个碱基病毒可以拯救而4或5个碱基不能被拯救。对插入突变致死的突变体分析发现可以检测到亚基因组5、6、7的转录及GP5、N蛋白的表达，说明突变没有影响病毒亚基因组转录和下游基因表达。通过对ORF4/ORF5区间序列分析发现其中存在潜在ORF5a，推测ORF5a蛋白为PRRSV复制过程所必须。本研究在2型PRRSVORF4/ORF5区间中，成功插入基因标识，为创制新型基因工程标记疫苗奠定了基础。 2、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF5a蛋白对病毒感染性影响解析 最新研究表明与PRRSV同属的马动脉炎病毒(EAV)ORF5a蛋白对病毒的感染性非常重要但非必需。而我们在对ORF5密码子优化及ORF4/ORF5基因区间插入研究过程中发现破环ORF5a将造成病毒拯救失败。因此，推测ORF5a蛋白在PRRSV复制过程中是必须的。为了进一步验证假设，利用1型(pSHE)和2型(pAJXM和pAPRRS)PRRSV全长感染性克隆，在不影响其它基因编码蛋白及亚基因组二级结构的情况下敲除ORF5a基因，构建全长感染性克隆pSHEk5a、pAJXMk5a、pAPRRSk5a。转染BHK-21细胞，结果突变病毒拯救失败，但是突变体病毒结构蛋白表达没有受到影响。接下来，通过在ORF5a敲除突变体过程中共同转染ORF5a真核表达载体的顺式互补实验证实，ORF5a敲除突变体可以利用顺式表达的ORF5a蛋白，包装出单轮感染性病毒粒子。说明突变病毒致死的原因是没有ORF5a蛋白的表达，证实ORF5a蛋白为病毒感染性必须。最后，在pAJXM全长感染性克隆中研究了不同长度ORF5a对PRRSV病毒复制的影响，结果发现46个氨基酸的ORF5a生长速度明显快于延伸后的类型，暗示ORF5a在病毒复制过程中起重要作用。 3、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究 通过对比目前在临床中分离的PRRSV基因组序列中ORF5a序列，发现在2型PRRSV中ORF5a蛋白29和30位存在保守半胱氨酸。为研究ORF5a蛋白保守半胱氨酸在病毒复制过程中的作用。我们将感染性克隆pAJXM中半胱氨酸突全部或部分突变为丝氨酸（serine），构建全长感染性克隆pAJXMS1、pAJXMS2、pAJXMSS。将突变体克隆转染BHK-21细胞均拯救出了突变病毒。说明ORF5a蛋白的保守半胱氨酸对病毒复制是非必需的，但pAJXMS2和pAJXMSS第30位突变为丝氨酸突变体病毒生长特性受到严重影响。接着，将pAJXM中半胱氨酸突全部或部分突变为甘氨酸(glycine)，构建全长感染性克隆pAJXMG1、pAJXMG2、pAJXMGG。pAJXMG2和pAJXMGG第30位突变为甘氨酸时无法拯救出病毒。随后，采用双分子互补荧光实验分析发现，ORF5a蛋白第30位突变为甘氨酸时影响ORF5a蛋白同源二聚体形成。体外实验分析ORF5a蛋白发现ORF5a蛋白同源二聚体通过非共价键形式形成。上述研究结果说明ORF5a蛋白的保守半胱氨酸对病毒复制是非必需，而ORF5a蛋白非共价键同源二聚体对PRRSV复制过程是必须的;ORF5a蛋白的第30位半胱氨酸为该蛋白的关键位点。 4、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用的研究 目前对于ORF5a蛋白与PRRSV其它结构蛋白相互作用关系仍不清楚。为了研究ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用关系，首先分析PRRSV感染MARC-145细胞过程中，ORF5a蛋白在MARC-145细胞中的定位，发现ORF5a蛋白主要定位于细胞的核周隙及细胞膜上，与病毒的其它结构蛋白有着类似的定位。接着，利用双分子互补荧光实验分析ORF5a蛋白与病毒其它结构蛋白相互作用发现，ORF5a蛋白可与GP4和2b蛋白有相互作用。采用免疫共沉淀实验证实了这个结果。综上所述，在本章中研究发现ORF5a蛋白与病毒的其它结构蛋白有着类似的定位且与病毒的GP4和2b蛋白有相互作用。这些结果为进一步了解ORF5a在病毒在复制过程的作用奠定基础。