表观遗传(epigenetics)是指DNA序列没有发生变化,但基因表达却发生了可遗传的改变,这种改变反映的是环境因素和遗传因素的相互作用。与人类多数疾病一样,肿瘤发生也有其自身的表观遗传学机制。DNA甲基化水平紊乱和组蛋白修饰异常是人类肿瘤最常见的表观遗传学改变。组蛋白在翻译完成后,其N-末端氨基酸残基发生乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化等共价修饰,引起染色体结构的改变,进而调控基因的转录表达。近年来,在人类多数肿瘤中都发现有组蛋白修饰酶和组蛋白修饰的异常。组蛋白H3磷酸化是组蛋白修饰的重要方式之一,其中第10位丝氨酸(Ser10)磷酸化与有丝分裂染色体浓缩、细胞周期以及基因转录调控密切相关,在肿瘤研究领域中具有重要意义。已报道多种肿瘤促进因子如表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA)、UVB和砷等以及原癌基因H-ras、v-Src均可诱导组蛋白H3Ser10磷酸化,与即刻早期(immediate-early, IE)基因c-fos、c-jun、c-myc以及Cox-2等转录激活有关。在人类多种肿瘤组织中包括直肠癌、肝癌、宫颈癌和胃癌等均发现有组蛋白H3SerlO磷酸化水平的增高,并且与肿瘤恶性程度相关。这些研究表明组蛋白H3SerlO磷酸化异常可能是调控细胞恶性转化的重要表观遗传学改变。大量研究证实各种体外刺激因素诱导的组蛋白H3SerlO磷酸化涉及多条不同的蛋白激酶信号通路,与特异性刺激/应激及细胞类型有关。近年来,各种蛋白激酶包括MSK1(mitogen-and stress-activated kinase1)、RSK2(ribosomal protein S6kinase2)、IKK-α (IkappaB kinase-alpha)、PKC (cAMP dependent protein kinase C)、Fyn及PIM1等相继被发现要参与调控不同刺激作用下组蛋白H3Ser10磷酸化,诱导特异性基因转录。在原癌基因H-ras、v-Src以及EGF、TPA诱导的细胞恶性转化中,MSK1活化对于组蛋白H3SerlO磷酸化以及激活蛋白-1(activating protein-1, AP-1)转录激活是必需的。因此,明确特异性刺激作用下调控组蛋白H3磷酸化的蛋白激酶及其信号通路对阐明组蛋白H3磷酸化的作用具有重要意义。鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)是高发于我国南方和东南亚地区的一种头颈部恶性肿瘤。流行病学调查显示,鼻咽癌的病因主要与Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus, EBV)、遗传因素及环境因素有关,EB病毒与环境危险因素及宿主易感遗传背景交互作用,促进鼻咽癌的发生、发展。鼻咽癌发病的独特病因体系提示：鼻咽癌是研究肿瘤表观遗传修饰的最佳模型之一。潜伏性膜蛋白1(latent membrane protein1, LMP1)是目前唯一证实具有转化功能的EBV基因编码瘤蛋白,与EBV相关肿瘤的发生密切相关。LMP1的转化作用在于它能异常激活AP-1、NF-κB、JAK/STAT信号通路和多个转录因子,调控靶基因表达,促进细胞增殖、转化、侵袭与转移。组蛋白H3Ser10磷酸化作为基因转录调控的重要机制,是否介导了LMP1诱导的转录因子活化和鼻咽细胞恶性转化,值得我们进一步探讨。本课题以组蛋白H3Ser10磷酸化为切入点,从组织、细胞、分子水平研究组蛋白H3Ser10磷酸化在鼻咽癌变,尤其是在EBV-LMP1促进鼻咽癌细胞恶性表型中的作用,并进一步探讨调控组蛋白H3Ser10磷酸化的蛋白激酶及信号通路,将有助于从表观遗传学角度揭示LMP1的致瘤机制和鼻咽癌的发生机制,为组蛋白H3Ser10磷酸化作为鼻咽癌诊断、治疗的新靶标提供一定的实验依据。第一部分组蛋白H3Ser10磷酸化在LMP1诱导鼻咽癌变中的作用第一章Ser10磷酸化组蛋白H3在鼻咽癌组织中的表达及其与LMP1表达的相关性方法1.免疫组织化学法检测鼻咽癌组织、慢性鼻咽炎症组织以及癌旁/正常组织中组蛋白H3Ser10磷酸化水平。2.免疫组织化学法检测EBV-LMP1在鼻咽癌组织的表达,并分析与组蛋白H3Ser10磷酸化水平的相关性。3.免疫细胞化学法和Western blotting检测低分化鼻咽癌细胞系CNE2、高分化鼻咽癌细胞系CNE1以及永生化鼻咽上皮细胞系NP69中组蛋白H3Ser10磷酸化水平。结果1.鼻咽癌组织中存在组蛋白H3Ser10磷酸化水平增高组蛋白H3Ser10磷酸化在48例鼻咽癌组织、15例鼻咽炎症组织和36例癌旁/正常鼻咽组织的阳性标记指数(positive labeling index, PLI)分别为22.43±10.57、14.87±6.04和8.10±4.78,显示鼻咽癌组织中组蛋白H3Ser10磷酸化水平要明显高于慢性鼻咽炎症组织(P<0.05)和癌旁/正常鼻咽组织(P<0.001)。慢性鼻咽炎症组织中H3Ser10磷酸化水平也要明显高于癌旁/正常鼻咽组织(P<0.005)。2.鼻咽癌组织中LMP1的表达与组蛋白H3Ser10磷酸化水平呈正相关关系在48例鼻咽癌组织中,LMP1阳性表达为28例(58.3%,28/48)。相关性分析结果显示,LMP1的表达与组蛋白H3Ser10磷酸化水平在鼻咽癌组织中呈正相关关系(χ2=6.700,P=0.01；C=0.350)。3.鼻咽癌细胞中存在组蛋白H3Ser10磷酸化水平增高免疫细胞化学法和Western blotting结果显示,与永生化鼻咽上皮细胞系NP69相比,组蛋白H3Ser10磷酸化水平在鼻咽癌细胞中明显增高,其中以CNE2细胞表达水平最高。第二章EBV-LMP1诱导CNE1细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化方法1.免疫细胞化学和Western blotting检测CNE1G和CNE1GL细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化水平。2. Western blotting检测瞬时转染LMP1基因引起CNE1细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化水平的改变。3.双荧光素酶报告基因系统检测转染LMP1基因引起CNE1细胞中AP-1转录活性的改变。结果1.LMP1诱导CNE1细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化水平增高免疫细胞化学结果显示,在血清饥饿条件下,组蛋白H3Ser10磷酸化的阳性细胞数在稳定表达LMP1的CNE1GL细胞中要明显高于转染空质粒的CNE1G细胞,主要为有丝分裂间期细胞。Western blotting结果也显示CNE1GL细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化水平明显高于CNE1G细胞。此外,瞬时转染LMP1基因亦可引起CNE1细胞组蛋白H3Ser10磷酸化水平的增高,呈剂量依赖关系。2.LMP1诱导CNE1细胞中AP-1转录激活双荧光素酶报告基因分析显示,转染LMP1基因可促进CNE1细胞中AP-1转录活性增高,呈剂量依赖关系。第三章基因沉默组蛋白H3对LMP1促进CNE1细胞增殖和转化的影响方法1.构建针对组蛋白H3基因和无关序列的siRNA真核表达质粒,与pcDNA6-Myc/HisB质粒共转染CNE1细胞,经杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定沉默组蛋白H3基因的CNE1细胞株及阴性对照细胞株,采用实时定量RT-PCR及Western blotting检测组蛋白H3基因沉默效果。2.采用CCK-8法、平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测基因沉默组蛋白H3对LMP1促进CNE1细胞增殖和转化的影响。3.双荧光素酶报告基因系统检测基因沉默组蛋白H3对LMP1诱导AP-1转录激活的影响。结果1.稳定干扰组蛋白H3基因表达的CNE1细胞株的建立经杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定表达细胞株,采用实时定量RT-PCR及Western blotting检测组蛋白H3基因沉默效果,结果显示,与空白对照及阴性对照细胞相比,siRNA-H3质粒转染的CNE1细胞中组蛋白H3的mRNA和蛋白表达水平下调60%-70%。2.基因沉默组蛋白H3抑制LMP1促进的CNE1细胞增殖和转化能力与以往的报道相一致,转染LMP1基因可促进CNE1细胞增殖及克隆形成；但采用siRNA干扰组蛋白H3表达则可明显抑制LMP1促进的细胞增殖及克隆形成能力。CCK-8实验结果显示,与阴性对照细胞相比,基因沉默组蛋白H3的CNE1细胞在培养48h后生长速度明显减慢；平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验结果显示,其克隆形成数量和克隆形成大小均明显减少,差异有统计学意义(P<0.005)。3.基因沉默组蛋白H3抑制LMP1诱导的AP-1转录激活双荧光素酶报告基因分析显示,干扰组蛋白H3基因表达可明显抑制LMP1诱导的AP-1转录激活,与阴性对照细胞相比,其转录活性下降62.49%,差异有统计学意义(P<0.005)。第四章过表达野生型和突变型组蛋白H3对LMP1促进CNE1细胞增殖和转化的影响方法1.将人组蛋白H3基因的cDNA重组于pcDNA6-Myc/HisB质粒以构建组蛋白H3野生型真核表达质粒(H3WT),并以此为模板,通过反向PCR法对组蛋白H3基因第31位碱基进行T→G的定点突变,获得组蛋白H3突变型真核表达质粒(H3S10A)。2.将野生型和突变型组蛋白H3表达质粒转染入CNE1细胞,杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定过表达野生型和突变型组蛋白H3的CNE1细胞株,Western blotting检测转染基因的表达。3.采用CCK-8法、平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测过表达野生型和突变型组蛋白H3对LMP1促进CNE1细胞增殖和转化的影响。4. Western blotting和双荧光素酶报告基因系统检测过表达野生型和突变型组蛋白H3对LMP1诱导的c-Jun、c-Fos蛋白表达以及AP-1转录活性的影响。结果1.稳定过表达野生型和突变型组蛋白H3的CNE1细胞株的建立经杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定表达细胞株,Western blotting结果显示,在转染组蛋白H3野生型(H3WT)和突变型(H3S10A)质粒的CNE1细胞中均可检测到标签(His)融合蛋白的表达,表明已成功构建过表达组蛋白H3的CNE1细胞株。2.过表达野生型组蛋白H3促进CNE1细胞增殖和转化能力CCK-8实验结果显示,与转染空质粒细胞相比,过表达野生型组蛋白H3可促进CNE1细胞的增殖,细胞在培养72h后生长速度明显增快；平板克隆形成实验结果显示,过表达野生型组蛋白H3可促进低血清条件下CNE1细胞克隆形成能力。软琼脂集落形成实验结果显示,与转染空质粒细胞相比,过表达野生型组蛋白H3可增强LMP1促进的CNE1细胞锚定非依赖性生长能力,其克隆形成率增加,差异有统计学意义(P<0.05)；但过表达突变型组蛋白H3并没有引起明显改变。3.过表达野生型组蛋白H3增强LMP1诱导的c-Jun、c-Fos蛋白表达及AP-1转录活性Western blotting结果显示,与转染空质粒细胞相比,过表达野生型组蛋白H3可增强LMP1诱导下c-Jun和c-Fos的蛋白表达水平；但过表达突变型组蛋白H3并没有引起明冠改变。双荧光素酶报告基因分析显示,过表达野生型,而不是突变型组蛋白H3,可增强LMP1诱导的AP-1转录活性,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分调控LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化的蛋白激酶信号通路第一章蛋白激酶MSK1调控LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化方法1.免疫组织化学法检测Thr581磷酸化MSK1在鼻咽癌组织及癌旁/正常组织中的表达,并分析与LMP1及Ser10磷酸化组蛋白H3在鼻咽癌组织中表达的相关性。2. Western blotting检测CNE1G和CNE1GL细胞中ERK1/2和MSK1磷酸化水平,以及转染LMP1基因引起CNE1细胞中ERK1/2和MSK1磷酸化水平的改变。3.体外激酶活性实验检测CNE1G和CNE1GL细胞中组蛋白H3激酶活性,以及MSK1抑制剂H89预处理后组蛋白H3激酶活性的改变。4.采用p-MSK1抗体免疫沉淀MSK1激酶,体外激酶活性实验检测CNE1G和CNE1GL细胞中MSK1激酶活性。5.ERK1/2抑制剂PD98059和MSK1抑制剂H89处理细胞,Western blotting检测CNE1细胞中LMP1诱导组蛋白H3Ser10磷酸化水平的改变。6.构建针对MSK1基因的siRNA表达质粒,与pcDNA6-Myc/HisB质粒共转染CNE1细胞,杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定沉默MSK1基因的CNE1细胞株,采用实时定量RT-PCR及Western blotting检测MSK1基因沉默效果。7. Western blotting检测干扰MSK1基因表达对LMP1诱导组蛋白H3Ser10磷酸化水平的影响。结果1.鼻咽癌组织中存在MSK1Thr581磷酸化水平增高48例鼻咽癌组织和36例癌旁/正常鼻咽组织的免疫组化结果显示,MSK1Thr581磷酸化水平在鼻咽癌组织中要明显高于癌旁/正常鼻咽组织,差异有统计学意义(P<0.001)。2.鼻咽癌组织中LMP1的表达与MSK1Thr581磷酸化水平呈正相关关系在48例鼻咽癌组织中,相关性分析结果显示,LMP1的表达与MSK1Thr581磷酸化水平呈正相关关系(χ2=9.600,P=0.002；C=0.408)；并且MSK1磷酸化水平与组蛋白H3Ser10磷酸化水平亦呈正相关关系(χ2=11.959,P=0.001；C=0.447)。3.LMP1促进CNE1细胞中MSK1Thr581磷酸化水平的增高Western blotting结果显示,稳定表达LMP1的CNE1GL细胞中ERK1/2和MSK1磷酸化水平明显高于转染空质粒的CNE1G细胞。此外,瞬时转染LMP1基因也可促进CNE1细胞中ERK1/2及MSK1磷酸化水平的增高,呈剂量依赖关系。4.LMP1增强CNE1细胞中组蛋白H3激酶活性体外激酶活性分析显示,与CNE1G细胞相比,CNE1GL细胞蛋白提取液中组蛋白H3激酶活性明显增高,但给予MSK1抑制剂H89预处理后,两种细胞的组蛋白H3激酶活性均出现降低。5.LMP1增强CNE1细胞中MSKl激酶活性采用p-MSK1抗体免疫沉淀MSK1蛋白,Western blotting结果显示,p-MSK1抗体能有效地将蛋白提取液中MSK1激酶下拉。体外激酶活性分析显示,与CNE1G细胞相比,来自CNE1GL细胞的免疫沉淀复合物的MSK1激酶活性明显增强。6.PD98059和H89抑制LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化Western blotting结果显示,较低浓度的PD98059(10μmol/L)和H89(5μmol/L)即能明显降低LMP1诱导的H3Ser10磷酸化水平,呈剂量依赖关系。7.稳定干扰MSKl基因表达的CNE1细胞株的建立经杀稻瘟霉素加压筛选获得稳定表达细胞株,采用实时定量RT-PCR及Western blotting检测MSK1基因沉默效果,结果显示,与阴性对照细胞相比,siRNA-MSK1质粒转染的CNE1细胞中MSK1的mRNA和蛋白表达水平下调70%-80%。8.基因沉默MSK1抑制LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化Western blotting结果显示,与阴性对照细胞相比,采用siRNA干扰MSK1基因表达可明显抑制LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化。第二章蛋白激酶MSK1在LMP1促进CNE1细胞增殖和转化中的作用方法1.采用CCK-8法、流式细胞术、平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测H89或基因沉默MSK1对LMP1促进CNE1细胞增殖和转化的影响。2.双荧光素酶报告基因系统检测H89或基因沉默MSK1对LMP1诱导AP-1转录激活的影响。结果1.H89或基因沉默MSKl抑制LMP1促进的CNE1细胞增殖和转化能力CCK-8实验结果显示,与阴性对照细胞相比,干扰MSK1基因表达可抑制LMP1促进的CNE1细胞增殖,细胞在培养48h后生长速度明显减慢；采用流式细胞术分析细胞周期分布,结果显示,与阴性对照细胞相比,干扰MSK1基因表达可引起Go/G1期细胞比例增加(P<0.001),而S期细胞比例减少(P<0.001),提示阻滞细胞周期G1/S进程可能是下调MSK1表达抑制细胞增殖的重要原因。平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验结果显示,H89或基因沉默MSK1表达均可明显抑制LMP1促进的CNE1细胞克隆形成能力,其克隆形成数量和克隆形成大小均减少,差异有统计学意义(P<0.005)。2.H89或基因沉默MSKl抑制LMP1诱导的AP-1转录激活双荧光素酶报告基因分析显示,与未处理组细胞相比,5μmol/L H89即可明显降低LMP1诱导的AP-1活性,呈剂量依赖关系；同样,采用siRNA干扰MSK1基因表达亦可明显抑制LMP1诱导的AP-1转录激活,与阴性对照细胞相比,其转录活性下降57.21%,差异有统计学意义(P<0.005)。第三章TAK1通过激活p38/MSK1通路参与调控LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化方法1.采用TAK1抗体免疫沉淀TAK1激酶,以MKK6重组蛋白为底物,体外激酶实验检测LMP1诱导TAK1激酶活性的改变。2.用活化的TAK1-TAB1激酶与组蛋白H3蛋白进行体外激酶反应,Western blotting检测TAK1能否体外磷酸化组蛋白H3。3.CNEl细胞转染LMP1基因,免疫荧光和免疫共沉淀法检测TAK1和Ser10磷酸化组蛋白H3在细胞内定位及其结合情况。4.构建针对TAK1基因的siRNA表达质粒,与pcDNA6-Myc/HisB质粒共转染CNE1细胞,杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定沉默TAK1基因的CNE1细胞株,采用实时定量RT-PCR及Western blotting检测TAK1基因沉默效果。5. Western blotting检测TAK1抑制剂5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1对LMP1诱导组蛋白H3磷酸化的影响。6.双荧光素酶报告基因系统检测5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1对LMP1诱导AP-1转录激活的影响。7. Western blotting检测5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1对LMP1诱导MAPK通路激酶ERK1/2、p38和MSK1磷酸化水平的影响。结果1.LMP1增强CNE1细胞TAKl激酶活性采用TAK1抗体免疫沉淀TAK1蛋白,Western blotting结果显示,TAK1抗体能有效地将蛋白提取液中TAK1激酶下拉。体外激酶活性分析显示,与转染空质粒相比,转染LMP1基因能够增强CNE1细胞中TAK1激酶活性。2.活化的TAK1-TAB1激酶体外磷酸化组蛋白H3Western blotting结果显示,活化的TAK1-TAB1激酶能引起组蛋白H3Ser10磷酸化水平的增高,呈剂量依赖关系,提示TAK1-TAB1激酶能在体外磷酸化组蛋白H3。3.TAK1与Ser10磷酸化组蛋白H3可能不存在细胞内共定位免疫荧光结果显示,在LMP1诱导下,TAK1主要表达在细胞质中,未见有明显核转移,提示TAK1与磷酸化组蛋白H3可能不存在细胞核内共定位。免疫共沉淀结果显示TAK1与磷酸化组蛋白H3未见有明显结合。4.稳定干扰TAKl基因表达的CNE1细胞株的建立经杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定表达细胞株,采用实时定量RT-PCR及Western blotting检测TAK1基因沉默效果,结果显示,与阴性对照细胞相比,siRNA-TAK1质粒转染的CNE1细胞中TAK1的mRNA和蛋白表达水平下调70%-80%。5.5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAKl抑制LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化Western blotting结果显示,与未处理组细胞相比,给予TAK1抑制剂5z-7-oxozeaenol作用细胞可降低LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化水平,呈剂量依赖关系,而H3Ser28磷酸化水平未见明显改变。TAK1siRNA结果与其一致。6.5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAKl抑制LMP1诱导的AP-1转录激活双荧光素酶报告基因分析显示,与未处理组细胞相比,给予5z-7-oxozeaenol作用细胞可降低LMP1诱导的AP-1转录活性,呈剂量依赖关系。同样,采用siRNA干扰TAK1基因表达亦可明显抑制LMP1诱导的AP-1转录激活,与阴性对照细胞相比,其转录活性下降59.38%,差异有统计学意义(P<0.005)。7.5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAKl抑制LMP1诱导的p38和MSK1磷酸化Western blotting结果显示,给予5z-7-oxozeaenol处理或基因沉默TAK1均能有效抑制LMP1诱导的CNE1细胞p38和MSK1激酶的磷酸化水平,而ERK1/2磷酸化水平未见明显改变,提示TAK1通过p38MAPK通路,而不是ERK1/2,调控MSK1活性。结论1.鼻咽癌组织中组蛋白H3Ser10磷酸化水平明显增高；EBV-LMP1可诱导CNE1细胞组蛋白H3Ser10磷酸化。2.组蛋白H3,尤其是Ser10磷酸化,在LMP1促进CNE1细胞增殖和转化中起重要调控作用,与其介导AP-1活性有关。3.MSK1作为组蛋白H3激酶,直接调控LMP1诱导的CNE1细胞组蛋白H3Ser10磷酸化；并在LMP1促进CNE1细胞增殖、转化中发挥重要作用,有望成为肿瘤治疗的新靶点。4.TAK1通过激活p38MAPK/MSK1通路参与调控LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化。