抗菌肽是一种广泛分布于自然界中具有抗菌活性的小分子质量蛋白质，在宿主抵抗病原生物中扮演着重要的角色。目前已从生物体内分离出多种具有抗菌活性的小分子质量蛋白质。这些抗菌肽表现出广谱的抗菌效能，且对正常的真核细胞没有毒性作用。更重要的是病原生物对抗菌肽不能产生耐药性。因此，抗菌肽作为一种潜在的抗菌药物引起人们的注意。 Cecropins是一种首先从Hyalophora cecropia血淋巴中分离得到的昆虫抗菌肽分子，由37个氨基酸残基组成；是一类具有高效广谱抗菌活性的小分子多肽。Cecropins在毫摩尔浓度的水平上就能杀死一些病原体，且对真核细胞毒性很小。Cecropins在受到病原体入侵或注射器皮下损伤时，由脂肪体和血淋巴合成。其杀死细菌的精确机制还不清楚，但其生物活性的作用靶点一般认为是细胞膜。目前，Cecropins对细胞膜的作用机制，主要是通过利用人工液态小囊、细菌和人造膜来研究。 在人工液态小囊的研究中，Cecropin A的生物活性依赖于其浓度。Cecropin A分子相对于脂质分子的比率较小时，可以形成小的离子通道；Cecropin A分子相对于脂质分子的比率较大时，形成的穿膜通道可以通过较大的探针分子。但是，不同Cecropin A浓度对于阴离子脂质体、中性膜结构的活性都是一样的。同时，细胞膜中的胆固醇并不能阻止Cecropin A形成离子通道，但可以阻止大通道的形成，防止较大的探针分子通过膜结构。在利用小囊的研究中，人们确定胆固醇和阴离子脂质体均不对Cecropin A的活性产生影响。 采用红外线波谱分析技术，分析Cecropin A对细胞膜的作用，可以更好的理解多肽在细胞膜上的活性。Cecropin A通过接近、粘附于细胞膜上，然后插入液态膜中，最终在膜中形成功能结构。Cecropin A的主要结构是在α-螺旋的基础上形成β-结构。α-螺旋的纵轴和β-结构的横轴与细胞膜表面相平行。这些发现猜测，Cecropin A对小囊的作用主要是由多个分子组装成的结构造成细胞膜缺损。 为了能够使Cecropin A作为一种可能的抗菌药物在医疗中使用，需要其具有较低的获取成本和大量的生产方式。因此在体外进行重组表达是最理想的方法。至今，各种表达系统，如原核表达系统、酵母表达系统和昆虫表达系统，均已被应用到重组表达抗菌肽中。由于抗菌肽对宿主细胞的毒性作用和细胞内蛋白酶的敏感性，使上述表达系统对天然抗菌肽的重组表达较为困难或仅能低水平的表达。 最近几年的研究中，将目光集中在了利用融合表达方式，在E.coli中表达蛋白质。融合表达不但可以降低抗菌肽对宿主细胞的毒副作用，并能保护其免受蛋白酶的降解。硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx）是一种还原酶，普遍存在于各种生物体中，其可以高水平在E.coli中表达。利用生物信息学分析Trx和Cecropin A，显示在两者的融合蛋白质结构中，Cecropin A分子的部分结构可以被Trx分子包裹。通过Trx分子对Cecropin A分子的包裹，使融合蛋白质遮蔽Cecropin A分子的生物活性，减少其对宿主细胞的毒性，可以在原核细胞表达系统中进行重组表达。为能够在融合蛋白质表达后，获得家蝇Cecropin A天然成熟肽（M. domestica mature cecropin，MC），本研究在Trx分子和Cecropin A分子之间加入色氨酸残基，设计构建胃蛋白酶水解位点，便于MC从融合蛋白质中释放。 融合蛋白质在细胞内的含量，主要由基因的转录水平、核糖体的翻译效率和蛋白质的半衰期决定。为了提高Trx＆MC融合蛋白质在原核表达系统中的表达量，本研究在融合蛋白质中连入了Ubiquitin（泛素）分子。Ubiquitin是一种在真核细胞中普遍存在的高度保守的小分子蛋白质，由76个氨基酸残基构成。其最主要的功能是标记需要通过蛋白酶降解的蛋白质分子，对细胞内各种蛋白质的稳定性起着调控作用。自身在细胞内较为稳定，不被细胞内一般蛋白酶水解。Ubiquitin作为融合蛋白质的伴侣分子已被证明在多种表达系统中有良好的表达。本研究在Trx&MC融合蛋白质的基础上，构建了Trx&Ubiquitin&MC融合蛋白质。通过在BL21（DE3）中诱导表达，比较在相同诱导条件下，两种融合蛋白质占全菌蛋白质的比例，确定Ubiquitin分子是否能够增加融合蛋白质在细菌内的稳定性、延长蛋白质的半衰期，增加融合蛋白质在全菌蛋白质中比例。 生物信息学（Bioinformatics）是一门交叉科学，它包含了生物信息的获取、处理、存储、分发、分析和解释等在内的所有方面，它综合运用数学、计算机科学和生物学的各种工具，来阐明和理解大量数据所包含的生物学意义。其分析是建立在既往获得的生物实验数据基础上，是将已知知识应用到未知领域的工具。其对基因、氨基酸肽链的分析全面、准确、迅速，是传统实验所不能比拟的。在实验前对家蝇Cecropin A氨基酸序列进行了分析，首先明确其氨基酸肽链的结构特点，确定其生物活性。同时对融合蛋白质氨基酸肽链结构的分析确定实验设计的合理性，对实验起到了指导预测作用。在构建融合蛋白质水解位点时，利用计算机扫描融合蛋白质肽链，查找肽链中存在和不存在的已知各种水解位点，选择构建适当的水解位点，避免实验的盲目性。通过生物信息学分析不同物种来源的Cecropin A氨基酸序列的差异性，揭示其内在特性。 在本研究中，克隆并体外表达了来自家蝇的cecropin A基因和ubiquitin基因，证明Ubiquitin分子可以提高融合蛋白质在细胞内的稳定性，并用抗血清鉴定Trx&MC融合蛋白质。通过水解融合蛋白质获得MC，体外液态生长抑制实验验证其在体外的抗菌能力。 目的： 1.克隆家蝇的cecropin A与ubiquitin基因。 2.构建pET32a-mc与pET32a-ubiquitin&mc原核表达质粒。 3. 鉴定Ubiquitin分子对融合蛋白质表达量的影响。 4.利用家蝇血淋巴抗血清，验证重组蛋白质。 5.水解纯化的融合蛋白质，获得MC多肽，并验证其体外抗菌活性。 方法： 1.生物信息学分析不同物种来源Cecropin A的差异，构建Cecropin A进化树，分析MC及Trx&MC的二级和三级结构。 2.采用针刺法诱导抗菌肽，并用RT-PCR技术从家蝇组织中克隆cecropin A和ubiquitin基因。 3.将mc与pET32a载体连接，构建pET32a-mc重组质粒。 4.将ubiquitin与pET32a-mc载体相连，构建pET32a-ubiquitin&mc重组质粒。 5.将上述表达质粒转化BL21 （DE3），IPTG诱导表达，并比较两种重组质粒蛋白质表达量的差异。 6.针刺家蝇幼虫诱导抗菌肽，并收集血淋巴免疫家兔制备抗血清。 7.双向琼脂糖扩散法验证抗血清的效价。 8.Western Blot分析重组蛋白质的免疫反应性。 9.纯化回收pET32a-mc质粒诱导表达产物。 10.水解融合蛋白质，释放MC多肽。 11.通过比较融合蛋白、MC、氨苄青霉素、LB液体培养基对细菌生长曲线的影响，确定其生物学活性。 结果： 1.Cecropin A具有种属间的差异。 2.MC为双亲性α螺旋结构，Trx&MC的三级结构显示MC被包裹入Trx分子内部，Trx分子可以屏蔽MC分子的生物活性，融合蛋白质可以在原核细胞表达系统中表达。 3.成功克隆mc与ubiquitin基因，并构建pET32a-mc与pET32a-ubiquitin&mc重组质粒。 4.经IPTG诱导后，重组蛋白质主要以可溶形式表达。 5.两种表达质粒在BL21 （DE3）宿主菌中，相同条件下pET32a-ubiquitin&mc质粒蛋白质表达量高于pET32a-mc质粒。 6.家蝇幼虫血淋巴免疫家兔制备抗血清，获得血淋巴抗血清。 7.Western Blot结果显示pET32a-mc质粒表达产物与多抗血清具有特异的免疫反应性。 8.融合蛋白质经纯化后水解，将MC释放。 9.通过细菌液态生长抑制实验，验证体外表达的MC具有抑制细菌生长的作用，无杀菌作用。 结论： 1.Cecropin A分子具有种属间的差异，但也具有高度保守的区域，氨基酸残基的组成对其活性影响不大，生物学活性主要由其空间结构和氨基酸残基的特性决定。 2.采用融合表达的方法可以在原核宿主菌中表达毒性蛋白质。 3.Ubiquitin分子可以提高融合蛋白质在细胞内的稳定性，增加融合蛋白质的表达量。 4.体外表达的MC具有明显的抑制细菌生长的能力，但不能杀死液体培养基中的细菌。