氨基酸是极具前景的生物化工产品,在食品、医药、饲料等行业应用广泛。L-异亮氨酸是医药级别高附加值的必需氨基酸,其主要工业生产方式是微生物发酵并且主要生产菌是谷氨酸棒状杆菌。相较于传统诱变育种的盲目性,代谢工程更具针对性。因此,利用代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌高产L-异亮氨酸,以满足不断增加的市场需求,引起愈来愈多关注。本研究应用基因组改造结合基于alr的营养缺陷型互补表达系统,从L-异亮氨酸生产菌株——谷氨酸棒状杆菌WM001出发,将多种代谢工程策略组合以改善L-异亮氨酸生产,最终构建无需添加任何抗生素的高产L-异亮氨酸菌株。主要研究结论如下:（1）通过强启动子tac替换关键基因ilvA的启动子和敲除基因alaT有利于前体物质——2-酮丁酸和丙酮酸积累,从而提高L-异亮氨酸生产并且减少副产物的产生;结合敲除基因brnQ避免L-异亮氨酸主动输入,有利于菌体生长并且进一步改善L-异亮氨酸生产。但是,更强启动子tacM并不能进一步提高L-异亮氨酸生产。基因组改造后,最佳突变菌株WM004在72-h摇瓶发酵中积累L-异亮氨酸20.0 g?L^-1,与野生型WM001相比,L-异亮氨酸水平增加21.9%,副产物水平明显下降。（2）在突变菌株WM004中构建基于alr的营养缺陷型互补表达系统,以避免添加抗生素来维持表达载体。相较于载体pJYW-4,本课题构建的回补载体pYCW-1更适用于敲除基因alr的突变菌株WM005。（3）将AHAS的第47位异亮氨酸突变成酪氨酸,由ilvBN2编码的突变AHAS更有利于L-异亮氨酸生产,同时避免L-缬氨酸的大量合成;串联表达基因ppnK1强化NADPH供应可以进一步提高L-异亮氨酸生产,重组菌株WM005/pYCW-1-ilvBN2-ppnK1在72-h摇瓶发酵中可以积累L-异亮氨酸23.7 g?L^-1,相较于对照WM005/pYCW-1,增加15.1%的L-异亮氨酸水平;进一步串联表达操纵子lrp-brnFE或者基因ilvC,ilvD和ilvE,不利于菌体生长和L-异亮氨酸生产,同时产生大量副产物;进一步串联表达操纵子hom1-thrB造成明显的菌体生长抑制,也不利于L-异亮氨酸生产。最优表达组合工程菌株WM005/pYCW-1-ilvBN2-ppnK1在无添加抗生素的72-h发酵中质粒几乎不会丢失。（4）最佳表达组合工程菌株WM005/pYCW-1-ilvBN2-ppnK1通过5-L发酵罐补料分批发酵,无需添加任何抗生素,72 h积累L-异亮氨酸32.1 g?L^-1,相较于野生型WM001,增加了34.3%的L-异亮氨酸水平,并且产生少量副产物。