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目的:调查河北省监测点流行前期和流行期健康儿童与手足口病(HFMD)患儿病原携带状况,并对主要病原进行特征分析,为做好HFMD的监测和预防提供科学依据。方法:1根据2009年河北省HFMD发病情况在省内建立6个市级监测点,包括石家庄市、保定市、邢台市、唐山市、廊坊市、张家口市。2研究对象为健康儿童和HFMD患儿,各监测点在流行前期和流行期进行采样调查。3应用荧光定量PCR的方法对所采集的标本进行检测,结果为EV阳性的进行分型,对部分HFMD患儿的标本进行病毒分离。4分别设计EV71和CA16的VP1区测序引物,进行序列测定,分别分析两者的核苷酸和氨基酸同源性,同时生成系统进化树,对病原基因特征进行分析。5应用软件进行数据处理和统计分析。结果:1河北省监测点儿童检测样本采集情况本研究共采集健康儿童305人,其中流行前期157人,流行期148人;采集与健康儿童匹配的HFMD患儿共297人,其中流行前期152人,流行期142人。2健康儿童荧光定量PCR分型检测结果检测健康儿童305人,其中54人EV阳性,阳性检出率为17.70%,健康儿童以其他EV为主,在阳性儿童中占83.33%,EV71和CA16在健康儿童中的阳性检出率较低,在阳性儿童中的构成仅为5.56%和11.11%。显示健康儿童EV感染以其他EV为主,EV71和CA16只占较少比例。健康儿童按采样时间分为流行前期和流行期,流行前期检测157人,17人EV阳性,阳性检出率为10.83%。流行期检测148人,37人EV阳性,阳性检出率为25.00%。健康儿童流行前期和流行期EV感染均以其他EV为主,分别占阳性标本的64.71%和91.89%,HFMD主要病原(主要病原指EV71和CA16两者合计)在两期所占的比例分别为35.29%和8.11%。流行期健康儿童EV阳性检出率(25.00%)高于流行前期(10.83%),且流行前期与流行期的病原构成有各自的特点,但均以其他EV为主。从地区分布上看,EV阳性率由高到低依次为保定28.21%,张家口26.19%,唐山22.50%,邢台21.43%,廊坊14.29%,石家庄8.00%。流行前期阳性率最高的是张家口40.91%,流行期阳性率最高的是保定市61.11%。邢台、保定、唐山流行期阳性率均高于流行前期。各地市HFMD病原构成不同。张家口市CA16和其他EV数量相当,其他各市均以其他EV为主。从人群分布上看,性别和年龄对于健康儿童EV感染和HFMD病原构成没有影响。3 HFMD患儿荧光定量PCR分型检测结果检测患儿297人,167人EV阳性,阳性检出率为56.23%,在患病儿童中,EV71占EV阳性数的48.50%,其次为CA16和其他EV,EV71+CA16仅有1人。显示HFMD患儿以EV71为主要病原,CA16和其他EV也有一定比例,并存在EV71和CA16合并感染的情况。HFMD患儿按采样时间分为流行前期和流行期,流行前期检测152人,79份EV阳性,阳性检出率为51.97%;流行期检测145份,88人EV阳性,阳性检出率为60.69%。对两期的EV阳性检出率和HFMD病原构成进行比较,检出率无显著性差异,但病原构成在两期上具有显著性差异。流行前期CA16和EV71所占构成均较高,分别为49.37%和39.24%,其他EV仅占11.39%,但是流行期时,EV71所占构成最高,上升至56.82%,其次为其他EV,所占构成上升至30.68%,CA16所占构成下降至11.36%。从地区分布上看,EV阳性检测率由高到底依次为石家庄61.36%,邢台60.98%,唐山57.50%,张家口53.49%,廊坊53.33%,保定45.00%。流行前期阳性率最高的是廊坊69.57%,流行期阳性率最高的是唐山90.00%,两期相比,唐山、邢台流行期检出率较前期明显上升,各地市HFMD病原构成情况不同并各具特点。从人群分布上看,性别和年龄对于HFMD患儿EV检出率和病原构成没有影响。这与健康儿童的结果一致。4健康儿童其他EV分型检测结果对健康儿童中其他EV阳性者进一步进行其他EV分型检测,以病毒RNA为模板,用相应引物进行RT-PCR扩增,目的片段位置和大小根据所用引物不同而不同。共检测16例,其中可以确定型别的有7例,采样日期均在流行期,2人为CB5阳性,1人为CA6阳性,4人为ECO14阳性。分别来自保定市3人(2人为CB5阳性,1人为CA6阳性),邢台市3人(均为ECO14阳性),唐山1人(ECO14阳性)。5病毒分离结果对PCR检测为EV阳性的患儿标本进行病毒分离,共分离得到61株。经鉴定分别为36株EV71,18株CA16,4株CA10,2株CA4,1株CA9。6序列分析比较15株EV71分离株VP1区特征,结果显示,核苷酸同源性为94.7%～100.0%,氨基酸同源性为98.7%～100%;比较发现,与A、B基因型VP1区同源性低,而与C基因型接近;进一步比较发现2010年河北省15株EV71均属于C4亚型,与全国不同省市和2009年河北省分离的EV71一致,均属于C4亚型C4a分支。13株CA16分离株间核苷酸同源性为90.8%～98.9%,氨基酸同源性为99.0%～100%;与A基因型G-10国际标准株(U05876)和2008年安徽阜阳株(EU812514)的核苷酸同源性和氨基酸同源性较低,与B基因型代表株中的B1亚型同源性较高,显示CA16毒株均属于B1亚型,并分处于两个分支。7分析系统发生树,2010年河北省EV71毒株与C4亚型代表株为同一分支,其中的C4a分支包括了近两年河北的EV71毒株和我国不同地区的代表株;河北省2009年和2010年的22株CA16毒株与国内外B1亚型代表株在进化树中分别属于B1a和B1b两个进化分支,共同进化流行。河北省近年来EV71和CA16基因型稳定,未发生变化。结论:1 2010年监测点健康儿童EV携带率高,流行期阳性率明显高于流行前期;各期各地病原构成不同,但主要以其他EV为主,EV71和CA16只占较小比例,并伴有CB5、CA6、ECO14。2河北省监测点HFMD患儿EV阳性率在流行前期和流行期没有变化;病原构成主要以EV71和CA16为主,其他EV占较小比例,但流行前期和流行期构成略有不同,EV71逐渐占据主要地位。3无论健康儿童还是HFMD患儿,未发现性别和年龄对EV检出率和病原构成存在影响。4河北省2010年EV71毒株处于C4亚型C4a分支;CA16为B1基因亚型,分别处于B1a和B1b两个进化分支。河北省近年来EV71和CA16基因型稳定,未发生变化。