论文部分内容阅读
本研究通过改良细胞培养方案,建立体外诱导RAW264.7细胞分化形成成熟破骨细胞(OC)的高效培养体系,在解决OC体外诱导相关难题的基础上,本研究另一方面,还从细胞、生化、形态学水平分析本实验室纯化的鲢鱼Cystatin在体外对小鼠RAW264.7细胞分化为OC的影响,以及其对成熟OC的影响,从破骨角度初步阐明鲢鱼Cystatin在骨生长过程中调节骨吸收的作用。本研究结果为高效、合理利用鲢鱼废弃物资源,变废为宝,奠定必要的实验基础,并提供可靠的理论依据。1.体外诱导RAW264.7细胞分化形成成熟OC的高效培养体系的建立本研究联合应用三种细胞因子M-CSF、RANKL和1α,25-(OH)2D3诱导Raw 264.7细胞分化为OC,同时利用低浓度胰酶短暂消化保证OC前体细胞始终保持单层细胞的生长状态,建立了体外诱导RAW264.7细胞分化为成熟OC的高效培养体系。通过改良培养方法,在诱导过程中,培养孔内的大部分区域始终保持单层细胞的生长状态。镜下观察和HE染色结果显示,诱导第12天时OC胞体覆盖培养面积的70%;FITC-phalloidin染色结果显示,伴随着OC成熟,伪足内的束状伪足小体逐渐变为环形,最终融合成带状肌动蛋白环环绕在胞质周围;免疫荧光染色结果显示OC表达的降钙素受体(CTR)较前体细胞显著增加;TRAP染色显示OC胞浆内呈现大量红色颗粒。上述结果均提示获得具有吞噬功能的成熟OC。2.鲢鱼Cystatin对骨吸收的影响首先,本研究探究了鲢鱼Cystatin对小鼠RAW264.7向OC分化的影响。①Alexa Fluor546-phalloidin荧光染色表明,对照组可见伪足小体簇融合而成的伪足小体带环绕OC周边胞质,荧光强度高;10ng/mL鲢鱼Cystatin组OC周边胞质内仅见很多小的环状伪足小体;100ng/mL鲢鱼Cystatin组OC周边胞质内仅看见点状分布的伪足小体簇;而500ng/mL浓度组无伪足小体簇形成。免疫组化法检测OC微管蛋白分布的变化,对照组可见环状微管蛋白环绕成熟OC细胞的周边胞质;随着鲢鱼Cystatin浓度升高,微管蛋白环厚度逐渐变小,直径逐渐变窄,荧光强度逐渐减弱,其中500ng/mL浓度组无微管蛋白环形成。②组织蛋白酶K(Cathepsin K CTSK)免疫荧光染色结果显示,培养12d时对照组OC表达大量CTSK,细胞膜和核周细胞质呈现较强的绿色荧光;而其他各组,OC表达CTSK的水平较低,绿色荧光强度降低,500 ng/mL组仅核周少量胞质中呈现微弱的绿色荧光。间接ELISA检测结果显示,随着培养时间的延长(3d、7d及11d),对照组培养液上清中CTSK浓度逐渐上升,10-500 ng/mL各组培养液上清中CTSK浓度则逐渐降低,其下降幅度与鲢鱼Cystatin浓度呈正相关,500ng/mL组CTSK浓度为零。③微板法检测Ca2+浓度的结果显示,随着培养时间的延长(3d、7d及11d)对照组培养液上清中Ca2+浓度逐渐上升,10-500 ng/mL鲢鱼Cystatin各组培养液上清中Ca2+浓度则逐渐降低,以500 ng/mL组降低幅度最为明显,至11d时培养液上清中Ca2+浓度基本为零。本研究还检测了鲢鱼Cystatin对成熟OC功能的调节,①Alexa Fluor546-phalloidin荧光染色结果显示,对照组OC周边胞质内可见带状的伪足小体带,荧光强度高;10ng/mL鲢鱼Cystatin组OC周边胞质中的伪足小体带解聚成大量点状聚集的伪足小体簇;1OOng/mL组OC周边胞质中仅见少量伪足小体簇;500ng/mL浓度组OC周边胞质中伪足小体消失。②免疫荧光组化法检测OC微管蛋白环分布的变化,结果显示:对照组成熟OC细胞周边胞质可见稳定的微管蛋白环,10ng/mL鲢鱼Cystatin组OC的微管蛋白环厚度变薄,荧光强度变弱,100和500ng/mL组微管蛋白环消失。③CTSK免疫荧光组化染色显示,对照组培养12d时OC表达大量CTSK,细胞膜和核周细胞质中均呈现较强的绿色荧光;其他各组OC表达CTSK的水平逐渐降低,绿色荧光的强度降低,500 ng/mL组仅核周少量胞质中呈现微弱的绿色荧光。间接ELISA检测培养液上清中CTSK浓度,随着培养时间延长,对照组培养液上清中CTSK含量逐渐上升,10-500 ng/mL鲢鱼Cystatin各组培养液上清中CTSK含量逐渐降低,下降幅度与鲢鱼Cystatin浓度呈正相关,500 ng/mL组CTSK浓度降为零。④微板法检测培养液上清Ca2+浓度,随着培养时间延长,对照组培养液上清中Ca2+含量上升,而10-500ng/mL鲢鱼Cystatin各组培养上清中Ca2+含量均降低,500ng/mL组降为零。⑤利用Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒检测鲢鱼Cystatin对OC凋亡的影响,对照组OC未出现凋亡,10ng/mL鲢鱼Cystatin导致30%的OC发生早期凋亡,100ng/mL鲢鱼Cystatin导致65%的OC开始进入晚期细胞凋亡,而500 ng/mL组OC则全部发生晚期凋亡。综上所述,本研究建立的体外诱导RAW264.7细胞至成熟OC的培养体系,可高效的诱导出成熟的OC,成功解决了 OC诱导的难题,为从细胞水平研究cystatin对骨吸收的影响,奠定了重要的实验前提和基础;本研究中500ng/mL鲢鱼Cystatin不仅抑制OC的分化、成熟,还抑制成熟OC的功能,下调CTSK表达水平,降低OC的骨吸收活性,这可能是由于鲢鱼Cystatin导致了成熟OC的凋亡及坏死。