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第一部分高压氧治疗对大鼠急性脑出血后脑水肿的影响目的:研究高压氧治疗对大鼠急性脑出血后脑水肿的影响及高压氧治疗对铁离子和凝血酶所致脑水肿的影响。方法:本实验采用雄性SD大鼠,共60只,体重300~350g,由复旦大学实验动物科学部提供。实验中高压氧治疗(HBO治疗)方案采用3.0标准大气压维持1h(加压时间为15 min,减压时间为25~30 min)。对照组假治疗方案采用1.0标准大气压的空气中维持1 h。实验分为三个部分:1.12只大鼠基底节内立体定向注射100μl自体股动脉血制成脑出血模型,模型制作1 h后大鼠接受HBO治疗一次(HBO组,n=6)或者假治疗一次(对照组,n=6),脑出血模型制作24 h后大鼠断头取脑,采用干湿重法测定脑组织水含量,另取12只大鼠基底节内立体定向注射100μl自体股动脉血制成脑出血模型,于脑出血模型制作后1 h后给予HBO治疗,24 h和48 h后分别再给予一次HBO治疗(HBO组,n=6),对照组大鼠(n=6)分别在对应时间点给予假治疗,两组大鼠均于脑出血模型制作72 h后断头取脑,采用干湿重法测定脑组织水含量。2.12只大鼠基底节内立体定向注射鼠凝血酶(5U/50μl生理盐水)1 h后接受HBO治疗一次(HBO组,n=6)或者假治疗一次(对照组,n=6),24 h后大鼠断头取脑,采用干湿重法测定脑组织水含量值。另12只大鼠基底节内立体定向注射FeCl2(1 mM,50ul)1 h后接受HBO治疗一次(HBO组,n=6)或者假治疗一次(对照组,n=6),24 h后断头取脑,采用干湿重法测定脑组织水含量。3.6只大鼠基底节内立体定向注射100μl自体股动脉全血制成脑出血模型1h后接受HBO治疗一次(HBO组,n=3)或者假治疗一次(对照组,n=3),脑出血模型制作24 h后处死大鼠,取血肿周围组织匀浆后采用Westernblot法检测HO-1蛋白的表达情况。另6只大鼠基底节内立体定向注射100ul自体股动脉全血制成脑出血模型1 h后接受HBO治疗一次(HBO组,n=3)或者假治疗一次(对照组,n=3),脑出血模型制作24 h后处死大鼠,取脑组织切片后行HO-1的免疫组织化学染色。实验数据的统计学分析采用Stata7.0统计软件进行,脑组织水含量数据和Western blot检测所得蛋白条带灰度像素值采用均数±标准差(x±s)表示,以P<0.05为差异具有统计学意义,两组之间均数对比采用完全随机成组设计资料的t检验。结果:1.基底节脑出血1 h后给予单次HBO治疗组大鼠右侧(血肿侧)基底节组织水含量为80.1±1.3%,显著低于对照组(81.4±1.1%,P<0.05)。2.基底节脑出血后连续三天每天一次HBO治疗组和对照组大鼠右侧(血肿侧)基底节组织水含量分别为81.8±0.7%和82.6±0.8%,两组间无显著性差异(P>0.05)。3.基底节内注射凝血酶(5U/50μl生理盐水)1 h后给予单次HBO治疗组大鼠和对照组大鼠右侧(注射凝血酶侧)基底节组织水含量分别为84.5±1.0%和84.6±1.4%,两组间无显著性差异(P>0.05)。4.基底节内注射铁离子(Fecl2 1 mM,50μl)24 h后,后给予单次HBO治疗组大鼠右侧(注射铁离子侧)基底节组织与皮层组织水含量分别为84.9±0.9%和82.8±1.0%,均显著高于对照组大鼠右侧(注射铁离子侧)基底节组织与皮层组织水含量(分别为82.1±1.9%和81.2±0.7%,P<0.05)。5.Western blot检测显示大鼠基底节脑出血后给予单次HBO治疗组大鼠血肿周围基底节组织内HO-1蛋白水平显著高于对照组(P<0.05),免疫组化染色显示HBO组大鼠基底节组织内HO-1免疫活性细胞明显少于对照组。结论:1.脑出血后1 h给予单次HBO治疗显著减轻大鼠脑出血24 h后脑水肿。单次HBO治疗不能显著减轻凝血酶所致脑水肿且显著加重铁离子所致脑水肿。提示单次HBO治疗减轻脑出血后24 h后脑水肿并非通过减轻凝血酶和铁离子所致脑水肿起作用的。脑出血后单次HBO治疗减轻脑出血后血肿周围组织内HO-1蛋白水平,这可能与脑出血后单次HBO治疗减轻脑出血24 h后脑水肿相关。2.脑出血后每天一次连续三天HBO治疗既未能显著减轻也未能显著加重脑出血后72 h脑水肿,表明脑出血后急性期给予HBO治疗对脑出血后脑水肿无显著影响,可能与出血后二至三天内血肿释放铁离子等血红蛋白降解产物,而HBO治疗显著加重了铁离子所致脑水肿有关,本研究提示脑出血后急性期不宜进行HBO治疗。第二部分高压氧预处理对大鼠急性脑出血后脑水肿的影响目的:研究高压氧预处理对大鼠急性脑出血后脑水肿的影响。方法:本实验采用雄性SD大鼠,共78只,体重300~350g,由复旦大学实验动物科学部提供。实验中高压氧预处理(HBOP)方案为采用3.0标准大气压维持1 h(加压时间为15 min,减压时间为25-30min)。假处理方案采用1.0标准大气压的空气中维持1 h。实验分为四个部分:1.36只大鼠接受连续两天(HBOP2d组,n=6)或者三天(HBOP3d组,n=6)或者五天(HBOP5d组,n=6)HBOP,或者接受接受连续两天(对照组2d组,n=6)或者三天(对照组3d组,n=6)或者五天(对照组5d组,n=6)假处理,最后一次预处理24 h后,采用基底节内立体定向注射白体股动脉血100μl制成脑出血模型,模型制作24 h后断头取脑,采用干湿重法测定脑组织水含量。另12只大鼠接受连续五天HBOP(HBOP组,n=6),或者连续五天假处理(对照组,n=6),最后一次预处理24 h后,采用基底节内立体定向注射自体股动脉血100μl制成脑出血模型,模型制作72 h后断头取脑,采用干湿重法测定脑组织水含量。2.6只大鼠接受连续五天HBOP(HBOP组,n=3)或者接受五天假处理(对照组,n=3),于最后一次预处理24 h后处死大鼠,取基底节脑组织行Western blot检测P44/42MAPK、p70S6K、HO-1蛋白的表达情况。另取6只大鼠接受连续五天HBOP(HBOP组,n=3)或者受五天假处理(对照组,n=3),于最后一次预处理24 h后处死大鼠,取基底节脑组织病理切片后行P44/42 MAPK、p70S6K、HO-1的免疫组织化学染色。3.12只大鼠基底节内立体定向注射5nmol P44/42MAPK的抑制剂—PD098059(PD098059组,n=6)或者50μl PD098059的载体溶剂—4%DMSO(对照组,n=6)后接受连续五天HBOP,最后一次预处理2411后,采用基底节内立体定向注射100μl自体股动脉血制成脑出血模型,模型制作24 h后断头取脑,采用干湿重法测定脑组织水含量。4.6只大鼠接受连续五天HBOP(HBOP组,n=3)或者连续五天假处理(对照组,n=3),最后一次预处理24 h后,采用基底节内立体定向注射自体股动脉血100μl制成脑出血模型,模型制作72 h后处死大鼠,取脑组织行HE染色,光镜下观察血肿周围组织炎症反应情况,另取切片行TUNEL法免疫组化染色,镜下观察血肿周围神经细胞凋亡情况。实验数据的统计学分析采用Stata7.0统计软件进行,脑组织水含量数据和Western blot检测所得蛋白条带灰度像素值采用均数±标准差(x±s)表示,以P<0.05为差异具有统计学意义,两组之间均数对比采用完全随机成组设计资料的t检验。结果:1.连续两天、三天HBOP组大鼠脑出血24 h后右侧(血肿侧)基底节组织水含量分别为81.0±1.2%和80.6±1.2%,对照组分别为81.3±1.1%和81.2±0.2%,两组间水含量数值均无显著性差异(P>0.05)。2.连续五天HBOP组大鼠脑出血24 h与72 h后右侧(血肿侧)基底节组织水含量分别为79.5±0.9%和81.6±0.7%均显著低于对照组(分别为81.2±1.2%和82.8±0.9%,P<0.05)。3.Westemblot检测显示大鼠基底节脑出血后给予单次HBO治疗组大鼠血肿周围基底节组织内P44/42MAPK、p70S6K、HO-1蛋白水平蛋白水平显著高于对照组(P<0.05),免疫组化染色显示HBO组大鼠基底节组织内P44/42MAPK、p70S6K、HO-1蛋白水平免疫活性细胞明显少于对照组。4.PD098059组大鼠血肿侧基底节组织脑组织水含量为80.8±1.1%显著高于对照组(79.6±0.5%,P<0.05)。5.HBOP组大鼠血肿周围炎症细胞浸润程度显著轻于对照组,血肿周围凋亡细胞显著少于对照组。结论:1.连续二天、三天HBOP未能显著减轻大鼠脑出血24 h后脑水肿,连续五天HBOP显著减轻大鼠脑出血后脑水肿2.连续五天HBOP显著上调大鼠基底节组织内P44/42 MAPK、p70 S6KHO-1蛋白水平。3.P44/42MAPK抑制剂—PD098059抵消了HBOP诱导的减轻脑出血后脑水肿的效应,表明P44/42 MAPK细胞信号转导途径在高压氧预处理诱导的脑出血后脑保护作用中起重要作用。4.连续五天HBOP显著减轻大鼠脑出血72 h后血肿周围炎症反应和神经细胞凋亡,这可能是HBOP减轻脑出血72 h后脑水肿的重要机制之一