背景与目的：大肠癌是严重危害人类健康的最常见的恶性肿瘤之一,在西方发达国家其发病率居于恶性肿瘤的第2位,近年来在我国发病率和死亡率均呈明显上升趋势。肿瘤干细胞是在实体肿瘤中发现的一个小的细胞亚群,其具有自我更新和分化、引发肿瘤并促进肿瘤生长、复发和转移的能力。干细胞是公认的大肠癌产生和治疗后复发的根源,也被认为是大肠癌治疗失败的重要原因。近年来包括手术、放化疗,生物及中医药在内的综合治疗,是目前肿瘤病人最佳的治疗方式。随着分子生物学及基因工程技术的不断发展,肿瘤的治疗已经不仅仅局限于手术治疗、放疗和化疗这三种传统的模式。基因工程是近年来的研究热点,随着基因学的发展,人们认识到,基因的改变是肿瘤发生、发展的基础。以大肠癌特异基因为靶向的治疗方式将成为治愈肿瘤的重要途径,但也面临着巨大挑战。研发一种可选择性根治CSC的手段,需要运用新技术来锁定实施治疗的准确靶点,以利于对其进行筛选、分离。因此研究了解有关筛选大肠癌干细胞的标志分子及其功能对于大肠癌的进一步研究、诊断及治疗具有重要意义。CD200是—种Ⅰ型膜糖蛋白,是高度保守的免疫超家族成员,表达于髓系,例如巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞中,CD200与CD200R间的相互作用可以传递抑制性信号减低髓样细胞的活性,改变其迁移,在免疫疾病和抑制排斥反应中作为一种免疫耐受信号。肿瘤的发展和复发的特点是发生免疫逃逸,而产生肿瘤免疫耐受是肿瘤通过逃避免疫系统的识别,使肿瘤能够继续生长,因此大肠癌干细胞可能通过CD200依赖的免疫机制逃避免疫监视,CD200的表达很可能是大肠癌肿瘤干细胞与肿瘤免疫之间的重要桥梁。同时,CD200也被发现表达于大肠癌、骨髓瘤、乳腺癌、脑癌、黑色素瘤和正常的间充质干细胞中,并且CD200的表达与这些肿瘤的发展进程有重要关联。综上,CD200被认为极有可能是一种新型的大肠癌干细胞标志,但这一说法仍缺乏充足的证据支持。我们前期动物实验发现高表达CD200的大肠癌细胞致瘤能力明显较CD200-大肠癌细胞强。同等数量的两群细胞,CD200+成瘤速度明显快于CD200-,且最终形成的瘤体更大。因此,根据本课题组前期科研成果,本研究首先分析CD200在多种大肠癌细胞系中表达情况,然后分选出阳性表达和阴性细胞进行体外成球及侵袭实验,进一步验证CD200为大肠癌干细胞表面标志。同时分析CD200特异性大肠癌基因表达谱,探究与大肠癌独特生物学特性相关的基因表达及信号通路作用情况,对研究大肠癌干细胞的作用机制及寻找根除大肠癌干细胞的潜在靶点至关重要。材料与方法：1.大肠癌细胞培养6种大肠癌细胞株(colo205;lovo;sw620;sw480;sw1116;HT29)在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养。2.流式检测CD200+细胞所占比例检测6种大肠癌细胞株CD200+细胞所占比例,收集约106个细胞,标记APC—CD200单克隆抗体,空白对照组标记APC—同源IgG单克隆抗体,4℃避光孵育20分钟,分析缓冲液洗涤2次,300g离心10分钟,重悬于分析缓冲液中准备上机检测。3.无血清培养colo205细胞将colo205细胞在含DMEM/F12(1:1),2%B27,20ng/ml EGF,10ng%ml b-FGF和10ng/ml LIF的无血清培养基中培养两周。4.流式分选CD200+Colo205大肠癌干细胞将无血清培养了2周的Colo205细胞消化成单细胞悬液,计数约107个细胞,标记APC—CD200单克隆抗体,空白对照组标记APC—同源IgG单克隆抗体,4℃避光孵育20分钟,缓冲液洗涤2次,300g离心10分钟,重悬后上机分选CD200+和CD200-细胞。5.体外成球实验将分选出的CD200+和CD200-细胞稀释成100个/ml的细胞悬液,取相同数量(100μL)悬液于96孔板中,无血清培养14天,每2天补充一次生长因子。14天后计数细胞数>50的干细胞球数。以干细胞球数/10计算初代成球率。再将己形成的干细胞球消化重悬重新铺板,计算后两代成球率。6.侵袭小室实验将CD200+和CD200-细胞重悬于DMEM/F12基本培养基中,然后取相同数量(5×104个)分别加入transwell、室上层小室中,下层小室中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。连续培养48h后,将膜取下,用结晶紫染色后,随机选取10个显微镜下视野计算侵袭过基底膜的细胞数量。7.基因芯片分析CD200+细胞与CD200-细胞的基因表达谱分别抽提两种细胞群的总RNA样本,质检合格后,制备芯片,经过杂交、洗脱、染色、检测、芯片图像采集及数据分析得到差异表达的基因,通过SAS在线分析系统对差异基因的功能和相关信号通路进行分析。8.QRT—PCR法检测基因mRNA表达分别抽提CD200+和CD200-细胞群的总RNA样本,通过SYBR(?) Premix Ex TaqTM检测GLI2RAC3PRKCB PPARD PPP5C FGF14FAS RPS6KA6CACNAIG SUFU MDM2MAP3K13基因的mRNA表达水平。聚合酶链反应循环步骤：95℃,30秒变性；95℃,5秒连续进行40个循环；60℃,20秒退火；65℃,20秒延伸；60℃,15秒分析溶解曲线。GAPDH作为内参基因。9.流式检测CD200+细胞在CD44+CD133+和CD44-CD133-大肠癌细胞中比例流式分选出CD44+CD133+和CD44-CD133-Colo205细胞,分别标记APC—PD200单克隆抗体,空白对照组标记APC—同源IgG单克隆抗体,洗涤后上机检测。10.QRT—PCR法检测基因mRNA表达分别抽提CD44+CD133+和CD44-CD133-Colo205细胞的RNA,逆转录成cDNA,置QRT—PCR反应仪中定量分析在CD200+Colo205细胞中高表达的GLI2AXIN2RAC3PRKCB PPP5C PPARD基因,在CD44+CD133+和CD44-CD133-Colo205细胞中的表达水平。11.丁酸钠诱导细胞分化计数1×106个Colo205细胞种植到10cm的培养皿中,培养24小时后,分别加入浓度为0,3,5,8,12mM的丁酸钠,孵育24小时。通过酶联免疫吸附剂测定(ELISA)细胞中碱性磷酸酶的变化量。12.QRT—PCR法检测基因mRNA表达分别抽提未经丁酸钠诱导和经丁酸钠诱导分化后的Colo205细胞的RNA,逆转录成cDNA,置QRT—PCR反应仪中定量分析CD200GLI2FAS PPARD AXIN2基因,在未经丁酸钠诱导和经丁酸钠诱导分化后的Colo205细胞中的表达水平。13.Western Blot方法检测蛋白表达分别抽提CD200+和CD200-两细胞群总蛋白样本,测定蛋白浓度,蛋白变性、蛋白上样、电泳、转膜、封闭、分别与—抗和二抗结合反应、最后ECL化学发光法检测并半定量分析β-catenin, Wnt3a, pLRP6, dv12, Wnt5a, LRP6, Naked1蛋白在两种细胞群中的表达。14.统计学分析采用SPSS16.0软件进行统计学分析,实验结果用均数±标准差表示,两组均数的比较采用独立样本t检验和两个独立样本非参数检验,多组均数比较采用One-Way ANOVA和多个独立样本参数检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.流式检测CD200+细胞的比例流式检测6种大肠癌细胞株中CD200+细胞所占比例均很低(<3%),将Colo205细胞无血清培养2周,再次检测CD200+细胞的比例为21.6±3.24%,SSM、SFM两组间比例差异有统计学意义,P值小于0.05。将无血清培养两周的Colo205细胞,进行流式分选,得到CD200+和CD200-Colo205细胞。分选得到的两群细胞再次通过流式检测验证其纯度,结果提示纯度达到95%以上。2.CD200+Colo205细胞具有更强的自我更新能力第一代CD200+细胞成球率为46.6±6.4%,而CD200-细胞成球率仅为9.3±2.1%。并且,随着传代增多,CD200+细胞的体外成球率呈现上升趋势,而CD200-细胞体外成球率呈下降趋势。3.CD200+Colo205细胞具有更强的侵袭能力经过48小时的培养,侵袭转移至下层小室的细胞经过染色、计数。CD200+细胞与CD200-细胞侵袭能力具有明显差异(p<0.05)。侵袭至下层小室的CD200+细胞数为535+52.37个,CD200-细胞数为106±18.69个,CD200+细胞具有更强的体外侵袭能力。4.CD200特异性大肠癌基因表达谱通过基因芯片检测了CD200+和CD200-大肠癌细胞的基因表达谱,发现这两群细胞间共有958个差异表达基因。其中CD200+细胞表达上调的基因共433个,CD200+细胞表达下调的基因共525个。表达上调基因主要包括与肿瘤增殖和侵袭相关的GLI2、RAC3PRKCB; PPARS家族成员PPARD,它参与脂类代谢、细胞增殖、炎症反应等密多种过程。表达下调基因包括促凋亡基因FAS及可能发挥肿瘤抑制作用的CACNA1G、 RPS6KA6。这些基因可能与大肠癌干细胞的恶性生物学特性有关。5.差异基因功能分析GO分析显示差异表达基因分属于多个分子功能家庭,包括催化、转运、连接、酶调节、转录调节等；参与多个生物过程,包括细胞增殖、细胞杀伤、免疫过程调控、代谢等；与细胞组成密切相关,包括细胞核、细胞质、胞质溶胶、细胞膜、线粒体构成等。6.差异基因与信号通路的相关性分析通过差异基因的Pathway分析,发现差异基因分布广泛,主要涉及代谢、免疫、Wnt信号通路、MAPK信号通路、钙信号通路、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路及各种疾病的信号通路等,其中与Wnt信号通路相关的差异基因有12条,在CD200+细胞中AXIN2, BTRC, CSNK2B, FZD8, MAPK10, PPARD, PRKACB, PRKACG, PRKCB, RAC3表达较CD200-细胞增高,GSK3B, PSEN1表达降低。7.qRT-PCR验证了芯片结果的可信性经过生物信息分析,筛选出部分在CD200+细胞中表达上调(GLI2RAC3PRKCB PPARD PPP5C FGF14)或下调(FAS RPS6KA6CACNAIG SUFU MDM2MAP3K13)的基因,通过qRT-PCR验证他们mRNA表达情况,结果表明qRT-PCR结果与基因芯片结果一致。8.CD200与CD44+CD133+大肠癌细胞间关系CD200与CD44. CD133存在明显的共表达,CD200绝大多数表达于CD44+CD133+大肠癌干细胞中,在CD44-CD133-大肠癌细胞中几乎不表达。部分特异基因在CD200+大肠癌细胞中与在CD44+CD133+大肠癌细胞中的表达趋势一致。9.丁酸钠诱导分化后的Colo205细胞中基因表达变化通过qRT-PCR的检测,我们发现CD200GLI2PPARD AXIN24种基因在经过丁酸钠诱导后的Colo205细胞中的表达较诱导前明显降低,而FAS表达增强。10.CD200+与CD200-细胞中Wnt信号通路相关蛋白的表达Wnt信号通路相关蛋白β-catenin, Wnt3a, pLRP6和dv12在CD200+Colo205细胞中表达较在CD200-细胞中表达增强；而Wnt5a、LRP6、Naked1在CD200+Colo205细胞中表达较在CD200-细胞中表达减弱。结论1.CD200可作为大肠癌干细胞的筛选标志CD200+细胞在常见的多种大肠癌细胞系中比例均极低,符合干细胞数量少的特点。CD200+细胞在无血清培养体系可自我更新和增殖生长。体外成球实验及侵袭实验证实CD200+大肠癌细胞富集了未分化的大肠癌细胞,具有很强的自我更新和侵袭能力。而CD200-细胞则大部分为己分化肿瘤细胞,自我更新和迁移能力较差。由此我们认为CD200+细胞具备干细胞定义的生物学特性,CD200可作为大肠癌干细胞的筛选标志。2.CD200+大肠癌细胞具有与CD200-大肠癌细胞完全不同的基因表达谱两种细胞间差异表达的基因涉及多种分子功能、生物功能和信号通路,提示大肠癌干细胞之所以具有独特的恶性生物学行为,其分子机制错综复杂。CD200+细胞高表达多种促癌基因,这些基因可能与肿瘤干细胞增殖、转移、凋亡、免疫反应等生物学特性有关,可作为纯化干细胞的标志及今后深入研究大肠癌机制的靶点。3.CD200与CD44+CD133+Colo205大肠癌干细胞存在共表达CD44+CD133+细胞目前可作为相对可信的大肠癌干细胞代表。CD200与CD44+CD133+干细胞存在明显的共表达,CD200绝大多数表达于CD44+CD133+大肠癌干细胞中,在CD44-CD133-大肠癌细胞中几乎不表达。与干细胞生物学特性相关的多个基因在CD200+大肠癌细胞中表达趋势与在CD44+CD133+大肠癌干细胞中的表达趋势一致。以上说明CD200的表达具有干细胞特异性,进一步证明了它作为大肠癌干细胞特异分子标志的可信性。4.丁酸钠诱导分化后的大肠癌细胞中CD200等特异基因表达变化CD200GLI2PPARD AXIN24种基因在经过丁酸钠诱导后的Colo205细胞中的表达较诱导前明显降低,而FAS表达增强。提示CD200GLI2PPARD AXIN2可能是未分化的原始大肠癌细胞的有效标志,而FAS的低表达可能与干细胞的异常凋亡机制相关。5.CD200与Wnt信号通路的相关性CD200可能通过激活Wnt/β-catenin经典信号通路发挥其抑制肿瘤免疫、促进肿瘤再生与转移的生物学特性。Wnt/β-catenin经典信号通路有望成为阐明大肠癌干细胞作用机制的潜在靶点。