阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)和沙门氏菌(Salmonella)是婴儿配方奶粉(Powdered infant formula,PIF)中常见的且伴随高发病率的两种食源性致病菌,可导致罕见但危及生命的新生儿脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎。新生儿由于食用被污染的婴儿配方奶粉致病甚至死亡的案例屡见不鲜,因此,建立快速有效的检测手段有利于预防疾病的发生同时更好地为食品安全保驾护航。传统的微生物检测方法主要是依靠培养基培养、生化血清鉴定、形态特征观察等,这些方法步骤繁琐,费时耗力,无法快速定量有害目标。本研究旨在建立一种恒温快速检测手段—实时定量重组酶聚合酶扩增技术(Real-time quantitative recombinase polymerase amplification,qRPA)同步快速检测婴儿配方奶粉中的阪崎克罗诺杆菌和沙门氏菌,主要对双重检测的构建和活菌的检测两方面进行探索和研究,进一步通过人工污染的方法来评估该技术在食品样品中的检测能力。主要研究内容及结果如下:1.双重qRPA方法的优化和建立针对阪崎克罗诺杆菌外膜蛋白A(outer membrane protein A,omp A)设计特异性探针,定位探针前后位置设计多条不同的引物,两两配对筛选出灵敏度/特异性最好的组合;针对沙门氏菌的侵袭蛋白A(invasion protein A,inv A),采用与阪崎克罗诺杆菌相同的方法来确定灵敏度/特异性表现最好的一组引物。将这两组最佳组合通过优化引物和探针的浓度,构建双重体系的扩增条件同时检测两种目标致病菌。结果表明:(1)该方法的反应温度为37°C,反应时间20 min;(2)阪崎克罗诺杆菌的探针和引物的浓度分别为200 n M和60 n M,沙门氏菌的探针和引物浓度为400 n M和120 n M;(3)阪崎克罗诺杆菌的检测限为10~4cfu/m L,沙门氏菌的检测限为10~3cfu/m L。2.双重qRPA方法在人工染菌PIF中的应用为了评估建立的方法在婴儿配方奶粉样品中的检测能力,采取人工染菌方法,分别将阪崎克罗诺杆菌和沙门氏菌的10倍系列稀释液侵染到无菌婴儿配方奶粉中作为待测样品进行检测。结果表明,在奶粉样品中该方法的检测限与在纯培养物中的达到一致,即阪崎克罗诺杆菌的检测限为10~4cfu/g,沙门氏菌的检测限为10~3cfu/g。考虑到实际样品中的污染水平很低,评估了在富集后该方法对PIF中对低于检测限水平值的目标菌数的检测情况,结果表明:在37°C富集8 h后可以检测到接种水平为0.1 cfu/g的沙门氏菌;在富集10 h后可以检测到接种水平为0.1 cfu/g的阪崎克罗诺杆菌。3.核酸嵌入剂结合q PCR和qRPA检测PIF中阪崎克罗诺杆菌活菌本研究成功的将改进的叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMAxx)与qRPA技术相结合,对PIF中阪崎克罗诺杆菌活菌进行了定量分析。针对阪崎克罗诺杆菌的α-葡糖苷酶(alpha-glucosidase,glu A)基因序列设计特异性的引物和探针,采取热处理灭活的方法在90°C下加热15 min制备死菌,利用不同浓度的PMAxx和不同长度的扩增子测试对死菌的影响。结果表明,扩增子长度和PMAxx浓度对死细胞有显著影响,PMAxx在10μg/m L的最佳浓度下,结合256 bp的RPA扩增子长度,完全抑制了10~8cfu/m L的死细胞,而PCR需要较长的扩增片段(338 bp)。在人工染毒的PIF中,PMAxx-qRPA可检测到10~3cfu/g的阪崎克罗诺杆菌活菌,PMAxx-q PCR的检测限为10~2cfu/g。在PMAxx-q PCR方法中,基质影响了PMAxx的处理效果,但在PMAxx-qRPA方法中,没有出现这种现象。在PIF样品中将0、10~7、10~6以及10~5cfu/g的活细胞分别与10~7cfu/g死细胞混合后,PMAxx-qRPA和PMAxx-q PCR方法完全消除了死细胞的假阳性信号(假阳性率为0)。将PMAxx-qRPA、PMAxx-q PCR、q PCR、qRPA和平板计数法比较,PMAxx-qRPA和PMAxx-q PCR法均明显优于q PCR和qRPA法,与平板计数法吻合最好。综上所述,本论文建立的这两种方法各有优势其中PMAxx-q PCR具有更高的灵敏度而PMAxx-qRPA具有更快的检测速度,它们都可以作为定量婴儿配方奶粉中活的阪崎克罗诺杆菌的有效工具。