研究目的:近些年来随着器官移植病人的增多，免疫抑制剂的广泛使用，广谱抗生素的滥用，以及介入性诊疗等医疗手段的普及与发展，侵袭性真菌感染在全球的发病率急剧上升，其对人类健康乃至生命的威胁已成为世界性的医学难题。在临床真菌感染中，念珠菌是最常见的致病真菌，其检出率在国内外医院血液标本中位列致病真菌的第一位。而在念珠菌感染中，又以白念珠菌最为常见，感染率最高。因此，对白念珠菌致病机制的研究以及新型抗真菌药物的研发对于临床防治真菌感染有着重要的意义。白念珠菌生长的一个显著特点是具有酵母态，假菌丝态和菌丝态三种细胞形态,三种细胞形态相互交织，又形成生物被膜。目前越来越多的研究表明菌丝态菌株以及生物被膜的形成是白念珠菌发挥致病力的关键，因此对于白念珠菌生物被膜和菌丝形成相关基因的研究对于阐明白念珠菌致病机制有着重要意义。本课题着眼于白念珠菌生物被膜和菌丝形成相关基因的筛选和发现，并深入探讨其影响生物被膜和菌丝形成的机制。此外体内筛选模型在研究真菌致病力和抗真菌药物筛选发现方面有着重要的作用，其中，无脊椎动物感染模型在近些年来发展迅速。本课题同时考察了无脊椎动物蜡螟模型在抗真菌药物评价上的应用。研究方法:第一部分：首先通过生物信息学分析，我们发现含硫氨基酸生物合成通路相关基因在白念珠菌生物被膜形成早期表达上调，其中ECM17基因可能参与了白念珠菌含硫氨基酸的生物合成并在菌丝和生物被膜的形成过程中发挥了重要作用。本研究通过HIS1-LEU2-ARG4基因敲除策略完成了对该基因的敲除和回复工作。BIGGY平板实验检测所构建菌株H2S的生成能力及在缺乏甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中的生存能力；XTT实验考察基因敲除前后菌株在不同甲硫氨酸和半胱氨酸浓度条件下生物被膜的形成能力；硅胶片粘附实验和细胞表面疏水性实验考察菌株粘附能力；SLD固体培养实验考察菌株的菌丝形成能力；Real-Time RT PCR考察基因敲除前后菌株重要粘附相关基因和菌丝形成相关基因的表达情况并分析其中的差异表达基因。此外，我们还检测了各菌株细胞内cAMP水平的变化，并分析了甲硫氨酸和半胱氨酸在影响菌株菌丝和生物被膜形成过程中所涉及到的信号通路的变化。第二部分：除了生物信息学分析的方法外，本研究前期还通过秀丽隐杆线虫筛选模型筛选得到6个可能影响白念珠菌菌丝形成和致病力的基因。在本研究中，我们首先用caSAT1基因敲除策略构建了该6个基因的缺失菌，并通过生长动力学实验，生物被膜形成实验，菌丝形成实验，药物敏感性实验等分别检测了基因缺失前后菌株的表型变化。之后我们又分别用了线虫，蜡螟，小鼠模型作为体内感染模型考察了各个基因敲除菌的致病力。结果显示NGG1基因对于白念珠菌的菌丝形成和致病力的影响较为明显。在进一步实验中，我们用基因表达谱芯片的方法考察了NGG1基因缺失前后，菌株在菌丝诱导条件下基因表达谱的变化。第三部分：蜡螟-白念珠菌感染模型已广泛应用于真菌致病力的研究，在此模型的基础上我们优化了给菌量，探索了给菌时间，并成功用该模型考察了不同抗真菌药物单用及合用的体内抗真菌效果。结果：1. ECM17基因实验结果：BIGGY平板实验证实与亲本菌SN101和回复菌KEC31相比，ECM17基因敲除菌KEC21的H2S生成能力大幅减弱，并在缺乏甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中不能生长，而外源性H2S的加入能够剂量依赖性地促进KEC21在缺乏甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中生长，证实ECM17通过控制H2S的合成来影响白念珠菌含硫氨基酸的生物合成。同时实验表明，基因缺失菌KEC21的生物被膜形成能力有所下降，粘附能力和菌丝形成能力显著降低，表明甲硫氨酸和半胱氨酸的缺乏影响了白念珠菌生物被膜形成的粘附和菌丝形成两个阶段。Real-Time RTPCR实验结果显示，当培养基中甲硫氨酸和半胱氨酸的含量较低时，白念珠菌的重要粘附相关基因ALS3和CSH1以及重要菌丝形成相关基因HWP1和ECE1在KEC21中的表达水平显著下降，表明这四个基因的表达下降可能是菌株生物被膜形成能力下降的重要原因。细胞内cAMP含量检测结果显示KEC21的cAMP含量明显降低，尤其是培养基中甲硫氨酸和半胱氨酸的含量含量不足时该现象更加明显。通过外源性加入cAMP，基因敲除菌KEC21的菌丝形成能力得以恢复。该结果表明cAMP-PKA信号通路的变化是甲硫氨酸和半胱氨酸影响白念珠菌生物被膜形成的重要原因。2. NGG1基因实验结果：本研究首先采用caSAT1基因敲除策略成功敲除了6株潜在影响白念珠菌菌丝形成和致病力的相关基因，通过表型研究发现其中NGG1基因可能对白念珠菌的生长，菌丝形成，生物被膜形成，各种药物刺激的敏感性和致病力有显著的影响。进一步实验结果表明，ngg1/生长速率减弱，平台期菌株浓度降低；在各种菌丝诱导培养基中菌丝形成能力降低；生物被膜形成能力下降；对氧化刺激，唑类药物以及作用于细胞壁的药物敏感性增强；对线虫，蜡螟，小鼠的致病力显著下降，甚至没有致病力。在菌丝诱导条件下，ngg1/的一些质膜、液泡、微粒体以及过氧化物酶体的相关基因表达上调，这些基因分别涉及到白念珠菌含氧酸、有机酸、羧酸、脂肪等的生物合成，转运，代谢以及细胞内的氧化还原反应。同时ngg1/中一些涉及到白念珠菌细胞成分的组织调控，染色体的分离和组成，细胞周期调控，有丝分裂调控，以及蛋白质修饰等的基因表达下调。该结果表明NGG1可能参与了白念珠菌的能量代谢通路并在白念珠菌有丝分裂过程中发挥重要作用。3.蜡螟-白念珠菌感染模型实验结果：蜡螟-白念珠菌感染模型用于评价抗真菌药物疗效的最佳给菌量为每只幼虫注射5×105CFU白念珠菌。我们用该模型成功用于氟康唑、两性霉素B、氟胞嘧啶以及两性霉素B和氟胞嘧啶协同作用的评价。因此，本研究提出了一个快速、廉价并且可靠的体内评价抗真菌药物疗效的方法。结论：1. ECM17基因实验表明：与浮游生长相比，白念珠菌生物被膜的形成需要更高剂量的甲硫氨酸和半胱氨酸。当外界甲硫氨酸和半胱氨酸含量不足时，菌株会自身合成这些氨基酸以满足生物被膜形成的需要。含硫氨基酸不足能够导致白念珠菌生物被膜形成能力显著降低，其机制与cAMP-PKA信号通路以及粘附和菌丝形成相关基因的下调直接相关。该发现提示含硫氨基酸不仅作为营养物质为白念珠菌的生长提供氮源，也作为信号分子参与白念珠菌生物被膜的形成。2. NGG1基因实验表明：线虫筛选模型作为新型无脊椎动物筛选模型，在筛选白念珠菌菌丝形成和致病力相关基因上具有显著的优势，根据该模型筛选得到的基因具有很好的研究价值。NGG1基因参与了白念珠菌的生长和菌丝形成等生物学过程，它的缺失引起了白念珠菌细胞内很多营养物质的生物合成，转运和代谢发生改变，并对白念珠菌的细胞周期，有丝分裂等产生影响。这些影响可以导致菌株的生长速率降低，菌丝形成能力下降及致病力减弱,其机制可能与该基因可能编码组蛋白乙酰化转移酶的生物学功能相关。3.蜡螟-白念珠菌感染模型实验表明：蜡螟模型作为无脊椎动物模型可用于抗真菌药物的筛选和评价。